向丹 王文濤 張益

(1荊門市中醫(yī)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 荊門 448000；2湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院手術(shù)室)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)具有發(fā)病率高、死亡率高和預(yù)后差的特點，其發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜；深入研究NSCLC發(fā)病機(jī)制可有助于篩選NSCLC診療的新靶點〔1〕。CCNE2作為調(diào)控細(xì)胞周期的因子，一直是腫瘤相關(guān)研究的熱點，有報道稱CCNE2信號通路的紊亂會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，如miR-664b-5p〔2〕、miR-26a和miR-30b〔3〕可調(diào)控CCNE2的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，并抑制細(xì)胞遷移和侵襲。且CCNE2在NSCLC組織和細(xì)胞中高表達(dá)，可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，在NSCLC治療和研究中發(fā)揮著重要作用〔4〕。關(guān)于miR-32在腫瘤中的研究早有報道，如miR-32靶向FBXW7促進(jìn)乳腺癌細(xì)的增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡〔5〕和靶向KLF4調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖和遷移〔6〕。而miR-32在NSCLC細(xì)胞的功能也已有研究，其在NSCLC組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著降低〔7〕。也有研究發(fā)現(xiàn)MiR-32可通過靶向調(diào)控TWIST1〔8〕和SOX9〔9〕抑制NSCLC細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。本實驗通過生物信息學(xué)分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)CCNE2可能是miR-32的靶基因，但miR-32是否可靶向調(diào)控CCNE2表達(dá)而影響NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程仍不清楚。因此，本研究旨在研究miR-32對NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響及其分子調(diào)控機(jī)制是否與CCNE2有關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清、 DMEM培養(yǎng)基購自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；CCK-8試劑購自上海益啟生物科技有限公司；胰蛋白酶購自上海恒渡生物科技有限公司；miRNeasy Mini試劑盒購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；Totol RNA提取試劑盒和miRNA實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)SYBR?試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；miR-NC、miR-32 mimics、miR-32 inhibitor購自上海吉瑪生物。CCNE2干擾RNA(si-CCNE2)和對照干擾RNA(si-NC)均由上海生物工程有限公司合成構(gòu)建。電化學(xué)(ECL)發(fā)光試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；GAPDH抗體、CCNE2抗體、辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗均購自上海恒斐生物科技有限公司；pcDNA3.1空載體、CCNE2過表達(dá)載體pcDNA3.1-CCNE2均購自賽默飛公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司。Transwell小室購于Millipore。清潔級雄性BALB/c小鼠(體重18～23 g，8～10周齡)，由上海斯萊克實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(滬)2012-0002。所有動物至少適應(yīng)相應(yīng)的飼養(yǎng)環(huán)境1 w。所有的動物實驗按照有關(guān)法律法規(guī)指導(dǎo)方法進(jìn)行，并獲得醫(yī)學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1肺癌組織標(biāo)本 收集荊門市中醫(yī)醫(yī)院2016年1月至2019年1月手術(shù)切除并經(jīng)病理切片確診為NSCLC的石蠟標(biāo)本30例。30例患者術(shù)后病理切片確診為NSCLC，患者經(jīng)手術(shù)切除癌組織，距離癌組織邊緣2～5 cm處切除的為癌旁組織。所有患者術(shù)前未接受過放化療。所有患者簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 正常支氣管上皮細(xì)胞株16-HBE和NSCLC細(xì)胞株H460、A549和H1299購自美國ATCC。將以上細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，然后將其放在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-32和CCNE2表達(dá) 提取16-HBE、H460、A549和H1299細(xì)胞的總RNA和miRNA，合成cDNA，按qPCR試劑盒進(jìn)行操作。MiR-32和U6引物來源于MicroRNA Real-time PCR試劑盒。miR-32引物正義鏈：5′-GCGGCGTATTGCACATTACT-3′，反義鏈：5′-TCGTATCCAGTGCAGGGTC-3′；U6引物正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反義鏈：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；CCNE2引物正義鏈：5′-ATTTGGCTATGCTGGAGGAA-3′,反義鏈：5′-GTGCTCTTCG GTGGTGTCAT-3′。GAPDH引物正義鏈：5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，反義鏈：5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期A549和H1299細(xì)胞，以1×105個/孔密度接種于6孔板中，隨機(jī)分為8組：NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-32組(轉(zhuǎn)染miR-32 mimics)、NC inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-32-NC)、miR-32 inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-32 inhibitor)、si-NC組(轉(zhuǎn)染對照干擾RNA)、si-CCNE2組(轉(zhuǎn)染CCNE2干擾RNA)、miR-32+vector組(共轉(zhuǎn)染miR-32 mimics和pcDNA3.1)、miR-32+CCNE2組(共轉(zhuǎn)染miR-32 mimics和pcDNA3.1-CCNE2)，具體步驟按照LipofectamineTM2000使用說明進(jìn)行。 48 h后，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，qRT-PCR和Western印跡分別檢測CCNE2 mRNA和蛋白表達(dá)水平；采用CCK-8法和Transwell法檢測細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力。

1.2.5CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將1.2.4中各組細(xì)胞，分別于培養(yǎng)12、24、48和72 h時，每孔加入20 μl的CCK-8溶液，然后于酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長下的吸光度值。實驗重復(fù)3次。

1.2.6Transwell小室檢測細(xì)胞遷移與侵襲能力 取1.2.4中各組細(xì)胞，遷移實驗：Transwell上室接種3×104個/孔細(xì)胞，侵襲實驗：有基質(zhì)膠的Transwell上室接種105個/孔細(xì)胞，兩者下室中均加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，用PBS漂洗，再分別用甲醇和0.5%結(jié)晶紫固定、染色。倒置顯微鏡觀察并隨機(jī)選5個視野的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測miR-32與CCNE2基因的靶向關(guān)系 生物信息學(xué)分析庫預(yù)測顯示miR-32與CCNE2 3′-UTR有結(jié)合位點。將構(gòu)建好的野生型CCNE2-WT和突變型CCNE2-MUT的熒光素酶報告質(zhì)粒分別與miR-NC、miR-32 mimics轉(zhuǎn)染至A549和H1299細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后換新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性，實驗重復(fù)3次。

1.2.8Western印跡檢測 提取A549和H1299細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)進(jìn)行蛋白定量度。變性后取20 μg蛋白樣品進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉液封閉后加入1∶2 000倍稀釋的一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜，加入1∶10 000稀釋的二抗，37℃下孵育1 h。加化學(xué)發(fā)光劑顯影成像，Image J分析條帶的灰度值，以目的條帶與GAPDH的比值表示目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.9異種移植瘤實驗 將2.5×106的對照細(xì)胞(H1299)或穩(wěn)定表達(dá)miR-32的細(xì)胞懸浮于200 μl無血清DMEM中，皮下注射到每只小鼠的1只(每組10只雄性BALB/C 小鼠，且經(jīng)病理切片確診為NSCLC)30 d。30 d后處死小鼠，測定各項參數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-32在NSCLC組織和細(xì)胞中低表達(dá) 癌組織中miR-32表達(dá)水平(0.35±0.04)顯著低于癌旁組織(1.14±0.13，P=0.000)；A549組(0.36±0.04)、H1299組(0.26±0.03)和H460(0.49±0.05)中miR-32表達(dá)水平顯著低于16-HBE組(1.12±0.13，均P<0.05)。

2.2過表達(dá) miR-32抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力 與NC組相比，miR-32組在A549和H1299細(xì)胞中miR-32表達(dá)顯著升高(均P=0.000)；與NC組相比，miR-32組細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P=0.000)。表明miR-32可顯著降低A549和H1299細(xì)胞的遷移和侵襲能力。見圖1，表1，表2。

圖1 過表達(dá)miR-32對細(xì)胞A549遷移、侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.3沉默CCNE2抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力 與si-NC組相比，si-CCNE2組A549和H1299細(xì)胞CCNE2、miR-32、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞活性均顯著下調(diào)(均P=0.000)。見表3、表4。表明沉默CCNE2可顯著降低A549和H1299細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

2.4CCNE2是miR-32的靶基因 生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-32與CCNE2 3′UTR存在結(jié)合位點見圖2；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-32能顯著降低CCNE2-3′UTR-WT的熒光素酶活性(P<0.01)，而不影響CCNE2-3′UTR-MUT的熒光素酶活性(P>0.05)，見表5；miR-32組A549和H1299細(xì)胞CCNE2蛋白表達(dá)顯著低于miR-NC組(P<0.01)；miR-32 inhibitor組A549和H1299細(xì)胞CC-NE2蛋白表達(dá)顯著高于NC inhibitor組(P<0.01)，見表6、圖3。

圖2 miR-32與CCNE2 3′UTR綜合位點

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 miR-32調(diào)控CCNE2的表達(dá)

圖3 miR-32靶向、調(diào)控CCNE2

2.5miR-32負(fù)調(diào)控CCNE2抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力 與miR-32+vector組相比，miR-32+CCNE2組CCNE2蛋白水平、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(均P<0.05)。見圖4，表7，表8。

圖4 CCNE2蛋白的表達(dá)

2.6miR-32在體內(nèi)抑制異種移植瘤生長 與NC組相比，miR-32組10 d腫瘤體積顯著變小(均P<0.01)；30 d后，對處死小鼠的腫瘤重量進(jìn)行測量，miR-32組腫瘤重量顯著降低(P<0.01)，miR-32組腫瘤細(xì)胞中miR-32表達(dá)上調(diào)，CCNE2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，見表9，圖5。

圖5 CCNE2蛋白的表達(dá)

3 討 論

研究表明miR-32在多種腫瘤中能夠發(fā)揮抗腫瘤作用，它在結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎癌、前列腺癌Wilm瘤中的表達(dá)水平顯著下調(diào)〔10〕。如 Zhao等〔6〕發(fā)現(xiàn)miR-32通過KLF4蛋白調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和遷移；Wu等〔11〕發(fā)現(xiàn)，miR-32通過調(diào)控PTEN蛋白調(diào)控腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。但miR-32在乳腺癌中的表達(dá)顯著上調(diào)，如Wei等〔5〕發(fā)現(xiàn)miR-32能靶向調(diào)控FBXW7的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和抑制細(xì)胞凋亡。miR-32在NSCLC細(xì)胞的功能也已有研究，它在NSCLC組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)〔7〕。有研究發(fā)現(xiàn)miR-32可通過負(fù)調(diào)控TWIST1〔8〕和SOX9〔9〕抑制NSCLC細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。miR-32可靶向AURKA基因從而抑制NSCLC細(xì)胞活力〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)miR-32在NSCLC組織、A549、H460和H1299細(xì)胞中顯著下調(diào)，表明，過表達(dá)miR-32可顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲；miR-32在體內(nèi)可明顯抑制異種移植瘤的生長，提示miR-32在NSCLC中能夠發(fā)揮抑癌作用。

腫瘤的一個重要生物學(xué)特征是有無限生長的潛能，癌基因的活化及抑癌基因通路的改變是腫瘤發(fā)生的重要因素〔13〕。細(xì)胞增殖受到細(xì)胞周期素、細(xì)胞周期依賴性激酶〔14〕及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的嚴(yán)格調(diào)控。CCNE2與CCNE1〔15〕同屬于細(xì)胞周期素E家族〔16〕，有研究報道CCNE2在非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中難以檢測到，但是在腫瘤性細(xì)胞中卻顯著升高〔17〕。目前國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)證明CCNE2在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如肺癌、胃癌〔13〕、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌〔19〕、腦癌等。如miR-664b-5p〔2〕、miR-26a和miR-30b〔3〕可調(diào)控CCNE2的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，并抑制細(xì)胞遷移和侵襲。研究顯示CCNE2在NSCLC組織和細(xì)胞中高表達(dá)，可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，提示CCNE2在NSCLC治療和研究中可能發(fā)揮重要作用〔4〕。本研究推測CCNE2可能是miR-32的潛在靶基因，進(jìn)一步的雙熒光素報告基因?qū)嶒炞C實了CCNE2是miR-32的靶基因，且miR-32過表達(dá)可負(fù)調(diào)控CCNE2表達(dá)，沉默miR-32可使細(xì)胞中CCNE2的表達(dá)上調(diào)，與過表達(dá)miR-32結(jié)果一致。本實驗結(jié)果表明miR-32可顯著下調(diào)腫瘤細(xì)胞中CCNE2蛋白表達(dá)，提示CCNE2在NSCLC細(xì)胞A549和H1299的增殖、遷移和侵襲過程中有重要作用，miR-32可負(fù)調(diào)控CCNE2表達(dá)參與其中。

miR-32在NSCLC中的作用已有報道〔7〕，miR-32調(diào)控NSCLC的機(jī)制十分復(fù)雜，本研究發(fā)現(xiàn)miR-32下調(diào)CCNE2抑制NSCLC細(xì)胞A549和H1299的增殖、遷移和侵襲，這一結(jié)果為NSCLC的治療和診斷提供了新的理論依據(jù)。