商倩 陳鑫 王邦茂 楊波 朱蘭平

(1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，天津 300041；2保定市第一醫(yī)院消化內(nèi)科)

惡性腫瘤已經(jīng)成為目前威脅人類生命健康的常見疾病之一，其具有惡性程度高、致死率高、病程快等特點(diǎn)，研究惡性腫瘤分子發(fā)生機(jī)制，尋找有效的靶基因抑制惡性腫瘤進(jìn)程是目前研究的熱點(diǎn)〔1〕。脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ型(INPP4B)作為一種脂質(zhì)磷酸酶，其對細(xì)胞內(nèi)磷酸激酶穩(wěn)態(tài)的維持具有關(guān)鍵作用〔2〕。INPP4B參與細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控過程，其是目前研究發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的調(diào)節(jié)基因〔3〕。研究顯示，INPP4B在卵巢癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡〔4〕。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，INPP4B在乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤中均扮演抑制作用，INPP4B可以通過調(diào)控蛋白激酶B(Akt)信號通路的激活水平發(fā)揮生物學(xué)作用〔5,6〕。目前已知INPP4B在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，并且其表達(dá)水平的高低與胃癌分化程度以及TNM分期相關(guān)，INPP4B可能是胃癌進(jìn)展中的抑制因子〔7〕?，F(xiàn)階段對于INPP4B在胃癌細(xì)胞增殖、凋亡中的作用還不明確。本研究旨在探討INPP4B在胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜細(xì)胞中的表達(dá)差異，通過慢病毒感染的方式上調(diào)胃癌細(xì)胞中INPP4B的表達(dá)水平，明確INPP4B對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 胃癌細(xì)胞AGS、HGC-27、NCI-N87購自上?；鄯f生物科技有限公司；正常胃黏膜細(xì)胞GES-1購自上海艾研生物科技有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；INPP4B過表達(dá)慢病毒和對照慢病毒由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成；Bcl-2抗體購自青島捷世康生物科技有限公司；p-Akt抗體購自廈門研科生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法測定INPP4B在胃癌細(xì)胞中的表達(dá) 收集胃癌細(xì)胞AGS、HGC-27、NCI-N87和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1，提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA。cDNA合成體系為：2 μl的隨機(jī)引物、20 μl的2×TS反應(yīng)混合物、2 μg總RNA、2 μl的去除DNA、2 μl的TransScript RT/RI Enzyme Mix，添加無RNA酶水至40 μl。cDNA合成條件為：25℃孵育10 min；42℃孵育30 min；85℃孵育5 min；4℃終止反應(yīng)。收集cDNA，進(jìn)行實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測，引物為：INPP4B正義鏈-5′-GGAAAGTGTGAGCGGAAAAG-3′，反義鏈-5′-CGA ATTCGCATCCACTTATTG-3′。β-actin正義鏈-5′-TA GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，反義鏈-5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。反應(yīng)體系為：10 μl的2×TS Top Green qPCR SuperMix、0.3 μl的上下游引物、0.4 μl的Passive Reference Dye、0.5 μl的cDNA，添加ddH2O至10 μl。PCR條件設(shè)置為：95℃ 50 s，74℃ 5 s，60℃ 34 s。INPP4B mRNA定量方法為2-△△Ct法。

1.3Western印跡測定INPP4B在胃癌細(xì)胞中的表達(dá) 收集胃癌細(xì)胞AGS、HGC-27、NCI-N87和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1，提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)方法檢測蛋白濃度。使用5%的濃縮膠和8%的分離膠進(jìn)行電泳，蛋白上樣量為30 μg。提取的蛋白樣品在添加至上樣孔之前與結(jié)合緩沖液混合煮沸5 min。初始電壓為60 V，觀察預(yù)染Marker進(jìn)入到分離膠時，把電壓調(diào)整到90 V。取出凝膠，以半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(0.45 μm)上，轉(zhuǎn)膜時電壓調(diào)整為15 V，轉(zhuǎn)膜時間設(shè)置為50 min。PVDF膜分別依次放在封閉液(5%牛血清白蛋白)、一抗(以1∶100稀釋)、二抗(以1∶4 000稀釋)反應(yīng)液中充分結(jié)合。在PVDF膜上滴加ECL超敏發(fā)光工作液，以Bio-rad采集圖像，根據(jù)灰度值分析蛋白表達(dá)量，內(nèi)參為β-actin。

1.4慢病毒感染 HGC-27細(xì)胞接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h以后，以MOI=30進(jìn)行慢病毒感染，培養(yǎng)24 h以后換液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h以后，用嘌呤霉素篩選5 d后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將感染INPP4B過表達(dá)慢病毒和對照慢病毒的HGC-27細(xì)胞命名為INPP4B和NC組，把沒有添加慢病毒液的HGC-27細(xì)胞命名為Control組。收集Control、NC、INPP4B組細(xì)胞，用實(shí)時熒光定量PCR和Western印跡測定細(xì)胞中INPP4B表達(dá)變化，步驟同1.2和1.3。

1.5四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測定上調(diào)INPP4B對HGC-27細(xì)胞增殖影響 Control、NC、INPP4B組按照每孔4 000個細(xì)胞種植到96孔板，在細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在每個孔內(nèi)依次添加MTT工作液各20 μl，孵育4 h以后將上清棄掉。在每個孔中加入150 μl的DMSO溶液，孵育震蕩10 min以后，在酶標(biāo)儀上檢測490 nm的A值。

1.6流式細(xì)胞術(shù)測定上調(diào)INPP4B對HGC-27細(xì)胞凋亡影響 收集Control、NC、INPP4B組細(xì)胞(每組106個細(xì)胞)，用PBS溶液洗滌3次以后，添加200 μl的結(jié)合緩沖液將細(xì)胞懸浮，再添加Annexin V-FITC和PI染色液各5 μl，置于避光條件下孵育結(jié)合15 min。用流式細(xì)胞儀檢測凋亡變化。

1.7Western印跡測定上調(diào)INPP4B對HGC-27細(xì)胞Bax、Bcl-2、p-Akt蛋白表達(dá)影響 收集Control、NC、INPP4B組細(xì)胞，按照1.3中Western印跡測定細(xì)胞中Bax、Bcl-2、p-Akt蛋白表達(dá)，Bax、Bcl-2、p-Akt抗體稀釋倍數(shù)分別為1∶600、1∶800、1∶400。

1.8Akt信號激活劑對上調(diào)INPP4B的HGC-27細(xì)胞增殖、凋亡影響 將感染INPP4B過表達(dá)慢病毒的HGC-27細(xì)胞用含50 ng/ml AKT信號通路激活劑IGF-1的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為INPP4B+IGF-1組，以INPP4B組細(xì)胞作為參照，細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，按照1.5中MTT比色法測定細(xì)胞增殖，按照1.6中流式細(xì)胞術(shù)方法測定細(xì)胞凋亡，按照1.7中Western印跡測定Bax、Bcl-2、p-Akt蛋白表達(dá)。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1INPP4B在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào) 胃癌細(xì)胞AGS、HGC-27、NCI-N87中INPP4B蛋白和mRNA水平明顯低于正常胃黏膜細(xì)胞GES-1(P<0.05)；胃癌細(xì)胞HGC-27中INPP4B蛋白和mRNA水平明顯低于胃癌細(xì)胞AGS、NCI-N87(P<0.05)。見圖1、表1。INPP4B在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，選用表達(dá)水平最低的胃癌細(xì)胞HGC-27作為研究對象。

圖1 Western印跡檢測INPP4B在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)變化

表1 正常胃黏膜細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞AGS、HGC-27、NCI-N87中INPP4B mRNA和蛋白水平

2.2INPP4B慢病毒感染上調(diào)HGC-27細(xì)胞中INPP4B表達(dá)水平 INPP4B慢病毒感染后的HGC-27細(xì)胞中INPP4B蛋白和mRNA水平均明顯升高(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測INPP4B慢病毒感染后HGC-27細(xì)胞中INPP4B蛋白表達(dá)

2.3上調(diào)INPP4B抑制HGC-27細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 INPP4B慢病毒感染后的HGC-27細(xì)胞A值明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表2、圖3、圖4。上調(diào)INPP4B抑制HGC-27細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測上調(diào)INPP4B對HGC-27細(xì)胞凋亡影響

圖4 Western印跡檢測上調(diào)INPP4B對HGC-27細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)影響

2.4上調(diào)INPP4B抑制HGC-27細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá) INPP4B慢病毒感染后的HGC-27細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表2、圖5。

圖5 Western印跡檢測INPP4B慢病毒感染后HGC-27細(xì)胞中p-Akt蛋白水平

2.5Akt信號激活劑對上調(diào)INPP4B的HGC-27細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)影響 INPP4B+IGF-1組p-Akt蛋白(0.62±0.06)明顯高于INPP4B組(0.34±0.06，P<0.05)。見圖6。

圖6 Western印跡檢測Akt信號激活劑對INPP4B慢病毒感染后HGC-27細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)影響

2.6Akt信號激活劑對上調(diào)INPP4B的HGC-27細(xì)胞增殖和凋亡影響 Akt信號激活劑IGF-1處理INPP4B慢病毒感染后的HGC-27細(xì)胞，細(xì)胞A值明顯升高，凋亡率明顯降低，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)明顯減少，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見圖7、圖8、表3。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測Akt信號激活劑對INPP4B慢病毒感染后HGC-27細(xì)胞凋亡影響

圖8 Western印跡檢測Akt信號激活劑對INPP4B慢病毒感染后HGC-27細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)影響

表3 Akt信號激活劑處理INPP4B慢病毒感染后的HGC-27細(xì)胞A值、凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平

3 討 論

INPP4B基因定位在人4號染色體上，具有C2脂質(zhì)結(jié)合域、磷酸酶結(jié)構(gòu)域和內(nèi)部神經(jīng)質(zhì)同源結(jié)構(gòu)域2，其可以去磷酸化磷脂酰肌醇而維持細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇的穩(wěn)態(tài)〔8〕。INPP4B與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)，其可以抑制惡性腫瘤的生長，INPP4B被認(rèn)為是一種抑癌基因〔4〕。上調(diào)INPP4B后的宮頸癌、乳腺癌細(xì)胞增殖能力明顯下降，細(xì)胞凋亡增多〔5,9〕。INPP4B在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，并且INPP4B表達(dá)變化與胃癌患者的TNM分期有關(guān)〔7〕。本研究結(jié)果表明INPP4B在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)INPP4B可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，說明INPP4B在胃癌中扮演抑制作用，這與上述研究結(jié)果相一致。細(xì)胞的凋亡是一個復(fù)雜過程，其受到細(xì)胞內(nèi)多種信號和基因的表達(dá)調(diào)控作用〔10〕。與細(xì)胞凋亡有關(guān)的調(diào)控蛋白有多種，其中Bcl-2是最為重要的與凋亡有關(guān)的蛋白家族之一〔11〕。Bcl-2蛋白家族成員在細(xì)胞凋亡過程中扮演的角色不同，其蛋白成員可以分成促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白〔12〕。Bax是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡發(fā)生時發(fā)揮誘導(dǎo)作用；Bcl-2在細(xì)胞凋亡發(fā)生時發(fā)揮抑制作用〔13～15〕。本研究結(jié)果說明上調(diào)INPP4B誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡發(fā)生。

INPP4B作用機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程有關(guān)。INPP4B是位于Akt信號通路上的一種蛋白酶，其可以作用于磷脂酰肌醇的D4磷酸基團(tuán)，降低Akt的活化水平，從而阻斷Akt信號激活〔16，17〕。Akt是一個多功能信號通路，與細(xì)胞的生長、分化及胚胎發(fā)育等有關(guān)，參與心血管系統(tǒng)疾病、免疫疾病的發(fā)生〔18～20〕。Akt在腫瘤組織中過度激活，其活化水平的高低與Akt磷酸化水平有關(guān)，p-Akt蛋白水平越高，Akt信號通路激活水平也就越高〔21，22〕。在卵巢癌中證實(shí)，INPP4B可以通過下調(diào)Akt信號通路的激活水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔4〕。本研究結(jié)果說明INPP4B抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡與調(diào)控Akt信號通路有關(guān)。