吳九如 劉子萱 劉新宇 張崇恒 曲姝妍 胡英華

(1長春中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，吉林 長春 130117；2香港浸會大學)

治療失眠的藥物存在成癮性、耐受性及宿醉感等相關(guān)不良反應(yīng)〔1，2〕，故開發(fā)出更具療效且不良反應(yīng)少的治療手段成為該領(lǐng)域的研究重點。針灸以激活內(nèi)源性物質(zhì)為治療手段，對人體傷害小、可行性高、無副作用，是目前較安全的一種治療手段，在臨床實踐中有明顯的治療效果。中醫(yī)學認為失眠的病因大致分為飲食不節(jié)、情志失常、勞逸失調(diào)和病后體虛等幾類，現(xiàn)代醫(yī)家治療失眠是以古代先賢醫(yī)家的理論為基礎(chǔ)，進行衍化發(fā)展，可分別從五臟、六腑、腦、營衛(wèi)、痰熱、血瘀論治〔3～7〕。盡管各個醫(yī)家看失眠的角度不同，論治的方法不同，失眠證型各有不同，然總的病機變化歸屬于陽盛陰衰，陰陽失交?；谶@一病機，本研究選擇針刺治療，針刺的治療原則主要以交通陰陽，寧心安神為主。

研究發(fā)現(xiàn)，腺苷作為存在于所有細胞中的天然嘌呤核苷〔8〕，它不僅是神經(jīng)細胞的代謝產(chǎn)物，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，是一種強效的內(nèi)源性睡眠因子，通過抑制下丘腦組胺能神經(jīng)元的神經(jīng)傳遞、激活γ-氨基丁酸神經(jīng)元、抑制腺苷受體A1、A2a發(fā)揮促進睡眠的作用，可顯著影響睡眠-覺醒規(guī)律〔9～13〕。本課題主要探討針刺睡眠相關(guān)穴位對大鼠腦組織中腺苷水平的影響及針刺后腺苷在腦組織中的動力學規(guī)律。

1 材料與方法

1.1實驗儀器 PF-53原子熒光分光光度計，普析通用儀器有限責任公司；FA1004B型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；高效液相色譜儀，美國Agilent公司；C18高效液相色譜柱，江蘇漢邦科技有限公司；針式濾器，海興亞凈化科技材料；SK-1型快速混勻器，可調(diào)微量移液器北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司；梅特勒AB135-S電子分析天平，特勒-托利多；Sigma臺式高速冷凍離心機3K15，德國Sigma公司。

1.2試劑與藥品 艾司唑侖1 mg(H37023047)，山東信誼制藥有限公司；鹽酸優(yōu)級純(GR)500 ml(1512071)，西隴化工股份有限公司；硼氫化鉀分析純(AR)100 g(Q/12HG4890-2007)，天津市化學試劑研究所；氫氧化鈉 AR 500 g(20110118)，北京化工廠；硝酸GR 500 ml(20150508)，北京化工廠 ；高氯酸 AR 500 ml(2014112)，天津市鑫源化工有限公司；腺苷標準品20 mg (110879200202)，中國食品藥品檢定研究院；檸檬酸鈉 AR 500 g(20080708)，北京化工廠；磷酸氫二鉀 AR 500 g(1504021)，西隴化工股份有限公司；甲醇色譜純 500 ml(20151117143)，山東禹王實業(yè)有限公司；娃哈哈純凈水 596 ml(201601181214)，杭州娃哈哈飲料有限公司；磷酸二氫鉀 AR 500 g(140110)，北京化工廠。

1.3動物分組 考慮到針刺的鎮(zhèn)靜催眠作用可能出現(xiàn)性別差異，所以每組都設(shè)計了性別差異對照。將600只SD大鼠(雌雄各半)隨機分為12組，每組50只，雌雄各半。第1組為空白組，不接受針刺；第2組為陰性對照組，針刺與睡眠無關(guān)的穴位；第3組為艾司唑侖組；第4組至第7組依次為百會、印堂、內(nèi)關(guān)、三陰交單穴位針刺組；第8組為百會+印堂組合針刺組，第9組為內(nèi)關(guān)+三陰交組合針刺組；第10組為百會+印堂+三陰交組合針刺組；第11組為印堂+內(nèi)關(guān)+三陰交組合針刺組；第12組為百會+印堂+內(nèi)關(guān)+三陰交組合針刺組。以針刺入穴位時開始計時，于0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h按照雌雄各半隨機取樣，分析腦組織中腺苷含量。

1.4實驗方法 每組按照實驗方案針刺刺激相關(guān)穴位，并留針20 min。以針刺入穴位時開始計時，按照取樣時間點雌雄各半隨機選出10只大鼠，進行斷頭處理，于冰浴中迅速取腦，稱重，制備腦組織勻漿液，取經(jīng)處理的腦組織勻漿上清液10 μl，注入高效液相色譜儀，測定腺苷含量。

1.4.1樣品處理方法 A液的配制：①在50 ml燒杯中加入適量的娃哈哈純凈水并向其中加入21 ml高氯酸，攪拌均勻并使其冷卻;②待其冷卻后轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中并用娃哈哈純凈水定容至刻度。B液的配制：精密稱定0.588 2 g檸檬酸鈉、6.846 6 g磷酸氫二鉀、0.074 5 g乙二胺四乙酸二鈉用娃哈哈純凈水溶解后定容至100 ml。按1∶5(W∶V)比例加入冰冷的A液中研磨充分，渦旋震蕩10 min，然后4℃，14 000 r/min，離心10 min。取上清，按A∶B=1∶3比例加入B液混合均勻，冰浴靜置1 h，4℃，14 000 r/min，離心10 min。取上清1 ml，加入2 mol/L NaOH溶液200 μl調(diào)節(jié)pH近中性，取10 μl于高效液相色譜儀測定腺苷含量。

1.4.2色譜條件 ODS-2 C18漢邦色譜柱(250×4.6，5 μm)，流速1 ml/min。柱溫32℃，流動相0.01 mol/L磷酸二氫鉀∶甲醇=90∶10，測波長260 nm。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

非催眠穴位針刺，空白組與陰性對照組小鼠腦組織中腺苷水平相近，均很低。接受百會、印堂、內(nèi)關(guān)、三陰交單穴位針刺組小鼠腦組織中腺苷水平明顯增高，同時間點4個穴位組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而且各組的動態(tài)變化呈現(xiàn)幾乎相同的規(guī)律：1.0 h的腺苷水平最高，0.5 h和1.5 h的腺苷水平位居第二，2.0 h的腺苷水平位居第三(P<0.01)，2.5 h的腺苷水平與陰性對照組和空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可以發(fā)現(xiàn)，百會、印堂、內(nèi)關(guān)、三陰交4個穴位在調(diào)節(jié)失眠的過程中會引起腺苷水平的變化，療效作用時間下降較快，在2.5 h后基本消失，說明單一穴位存在時效性短的不足。百會+印堂組合針刺組和內(nèi)關(guān)+三陰交組合針刺組與接受單穴位針刺組比較，小鼠腦組織中腺苷水平在各時間點均明顯升高(P<0.01)，兩個雙穴位組之間各時間點比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而且各組的動態(tài)變化呈現(xiàn)幾乎相同的規(guī)律：1.0 h和1.5 h的腺苷水平最高，0.5 h和2.0 h的腺苷水平位居第二， 2.5 h的腺苷水平與陰性對照組和空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明穴位配伍會提高針刺治療失眠的腺苷水平，百會+印堂療效明顯高于內(nèi)關(guān)+三陰交(P<0.01)，表面同功穴配伍的療效相對顯著。接受三穴位針刺的小鼠腦組織中腺苷水平較接受雙穴位針刺的小鼠在各時間均有明顯升高(P<0.01)。對于特定的時間點，2個三穴位組之間沒有差異，而且各組的動態(tài)變化呈現(xiàn)幾乎相同的規(guī)律：1.0 h和1.5 h的腺苷水平最高，0.5 h和2.0 h的腺苷水平位居第二，2.5 h的腺苷水平略高于陰性對照組和空白組和雙穴位組。接受四穴位針刺的小鼠腦組織中腺苷水平較接受三穴位針刺的小鼠在各時間均有明顯升高(P<0.01)，雖然動態(tài)變化規(guī)律與接受三穴位針刺的各組的動態(tài)變化幾乎相同，但2.5 h的腺苷水平卻高于三穴位針刺的各組，明顯高于陰性對照組和空白組和雙穴位組(P<0.01)。針刺刺激的睡眠相關(guān)穴位越多，大鼠腦組織中腺苷水就越高并且持續(xù)的時間也越長。同時刺激4個穴位的作用效果與艾司唑侖的作用效果幾乎相同(P>0.05)，這與針灸臨床實踐的結(jié)果相吻合。無論是否收到外界刺激，雄性大鼠腦組織中的腺苷水平均高于雌性大鼠腦組織中的腺苷水平(P<0.01)，見表1，表2。

3 討 論

睡眠是人體自身存在的一種保護屏障，是保持身心健康的根本。中醫(yī)學強調(diào)人體與自然界為一個整體，而睡眠正是遵循了“日出而作，日落而息”的自然界規(guī)律。睡眠可以幫助人體恢復能量，能對人體的軀體經(jīng)絡(luò)和神經(jīng)系統(tǒng)進行修復。人體的各組織器官，每天都處在高耗能的生理活動中，睡眠可以幫助修復、合成、補充人體生命活動中所需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時代謝掉機體內(nèi)垃圾堆積，使人有足夠的體力和精力。那么反之，失眠就會導致一系列的機體失衡，造成嚴重后果。

目前，臨床上治療失眠的主要手段還是依靠苯二氮卓類安眠藥物，但該類藥物具有一定的成癮性和藥物依賴性，長期治療效果不明顯，還會給患者造成巨大的身心壓力。近幾年來，隨著人們生活水平及思想意識的提高，針灸以其便捷，安全，無副作用深受患者的歡迎和信任，越來越成為失眠患者的首選。失眠患者普遍存在著下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)系統(tǒng)過度激活，HPA軸的亢進導致神經(jīng)過于興奮，從而引起失眠〔14〕。腺苷是可以影響睡眠-覺醒規(guī)律的一種內(nèi)源性物質(zhì)。腺苷通過抑制神經(jīng)元的活性，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)來改善睡眠覺醒過程。腺苷可以抑制下丘腦組胺能神經(jīng)元的神經(jīng)傳遞，延長大鼠的NREM睡眠；通過腹外側(cè)視前區(qū)，激活γ-氨基丁酸神經(jīng)元促進睡眠；通過腺苷受體(A1、A2a受體)抑制下丘腦神經(jīng)元放電，促進睡眠〔15〕。而針刺穴位可以促進腺苷的分泌，通過穴位配伍增強其療效，從而大腦中的興奮性神經(jīng)元和激活促眠神經(jīng)元，達到促進睡眠的作用。

本文結(jié)果表明，針刺刺激與睡眠相關(guān)的穴位，可以產(chǎn)生類似于治療失眠的藥物的作用，即均可以提高大鼠腦組織中與睡眠相關(guān)內(nèi)源性物質(zhì)腺苷的水平。而且針刺刺激的睡眠相關(guān)穴位越多，在同一時間點腦組織中腺苷水平峰值就越高。由此可見，增加針刺刺激與睡眠相關(guān)的穴位的數(shù)量，與增加治療失眠的藥物的給藥劑量有相似的作用。這無疑為例臨床上針刺治療失眠提供了藥物動力學依據(jù)。針刺刺激的睡眠相關(guān)穴位越多，大鼠腦組織中的腺苷水平就越高，并且高于對照組腺苷水平持續(xù)的時間就越長，這為臨床上的針刺治療提供了定量的選擇依據(jù)。雖然腺苷是通過刺激可以提高其在腦組織中水平的內(nèi)源性物質(zhì)，但是，這種有效的刺激部位不僅是有限的，而且是特定的。盡管腺苷是遍布全身的內(nèi)源性物質(zhì)，但是卻不是任何穴位的刺激都可以提高其在腦組織中的水平，這表明：百會、印堂、內(nèi)關(guān)、三陰交等穴位在與腺苷的信號通路中相關(guān)。腺苷在腦組織中水平的提高，可能來源于針刺刺激特定穴位導致的機體其他部分的腺苷向腦組織中的定向遷移，也可能來源于針刺刺激特定穴位導致的體內(nèi)腺苷的迅速生成。