張濤 楊扉扉 王藜篥 黃華 張松 曹永飛

(貴州省骨科醫(yī)院骨外科，貴州 貴陽 550002)

骨密度(BMD)降低是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折的重要原因〔1〕。骨質(zhì)疏松與骨代謝失衡密切相關(guān)，成骨細(xì)胞造骨量與破骨細(xì)胞吸收量處于動(dòng)態(tài)平衡，若破骨細(xì)胞增加可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生〔2，3〕。因而深入探究骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制并抑制破骨細(xì)胞活性可為該疾病的防治提供新方向。既往研究表明微小RNA(miRNA)在破骨細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，而早期預(yù)測骨質(zhì)疏松骨折風(fēng)險(xiǎn)有利于該疾病的預(yù)防與治療〔4，5〕。微小RNA-187(miR-187)在骨質(zhì)疏松性骨折患者中低表達(dá)，miR-187過表達(dá)可促進(jìn)成骨前體細(xì)胞增殖并抑制其分化〔6〕。有報(bào)道指出Notch信號(hào)通路與破骨細(xì)胞增殖及凋亡有關(guān)〔7〕。但miR-187是否通過調(diào)控Notch信號(hào)通路而影響破骨細(xì)胞增殖及凋亡尚未可知。本研究主要探討miR-187與Notch信號(hào)通路的相關(guān)性及其對骨質(zhì)疏松的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2017年5月至2018年6月貴州省骨科醫(yī)院收治的60例骨質(zhì)疏松性骨折患者作為實(shí)驗(yàn)組，50例骨折但未發(fā)生骨質(zhì)疏松患者作為對照組，實(shí)驗(yàn)組與對照組年齡、性別與體重指數(shù)(BMI)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。同時(shí)應(yīng)用雙能X線骨密度儀(上海企晟醫(yī)療器械有限公司)檢測兩組患者腰椎正位總體L1～4 BMD。實(shí)驗(yàn)組患者均符合骨質(zhì)疏松性椎體骨折診斷標(biāo)準(zhǔn)〔8〕。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)影像學(xué)診斷為椎體骨折。排除標(biāo)準(zhǔn)：炎癥或占位性病變等引起的病理性骨折；既往椎體受傷病史；患有椎管狹窄及爆裂性椎體骨折；合并心腦肝等重要臟器損傷患者；藥物引發(fā)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松患者；強(qiáng)直性脊柱炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者；近期服用影響骨代謝藥物者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。兩組均于入組后次日清晨抽取空腹外周靜脈血2 ml，4℃條件下經(jīng)3 000 r/min離心10 min(離心半徑3 cm)，吸取血清置于離心管內(nèi)，放入-20℃超低溫冰箱保存待測。

表1 兩組臨床資料對比

1.2大鼠實(shí)驗(yàn)

1.2.1主要試劑 10只清潔級SD大鼠，體重70～120 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0008。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶購自上海玉博生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量 PCR(qRT-PCR)試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；甲基噻唑基四唑(MTT)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA蛋白裂解液購自美國Sigma公司；兔抗鼠細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)蛋白(Bax)多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠Notch1、Jagged1、Delta樣蛋白(DLL)3、Notch2抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；Lipofectamine2000購自北京索萊寶科技有限公司；miR-187模擬物(mimics)及陰性對照均購自上海吉瑪公司。

1.2.2骨質(zhì)疏松大鼠模型建立 取SD大鼠，禁食12 h，將0.5 g的阿托品注射入大鼠肌肉內(nèi)，使用水合氯醛(體積分?jǐn)?shù)3.6%)麻醉大鼠，消毒與鋪巾，從大鼠背部正中作為切口并取出肋緣下側(cè)雙側(cè)卵巢，縫合切口，使用無菌紗布與油紗雙層敷料覆蓋創(chuàng)傷面，包扎后給予抗生素，目的是預(yù)防感染，待大鼠清醒后常規(guī)飼養(yǎng)，檢測大鼠血、尿與骨骼參數(shù)等判斷造模是否成功〔9〕。

1.2.3大鼠原代破骨細(xì)胞分離及培養(yǎng) 10只大鼠均造模成功，采用頸椎脫位法處死大鼠，乙醇消毒后取大鼠兩側(cè)股骨、脛骨及其周圍軟組織，去除兩端骨骺，骨髓腔暴露，采用DMEM培養(yǎng)基(50 ml)沖洗骨髓腔直至其骨面變白，白色沉淀物即為破骨細(xì)胞樣細(xì)胞團(tuán)，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，輕輕吹打混勻，用200目細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，取過濾后的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml，輕輕吹打混勻，接種至培養(yǎng)瓶，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，更換培養(yǎng)液，每隔2 d更換一次培養(yǎng)液，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)〔10〕。破骨細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS、青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞穩(wěn)定傳代3～5代后，取對數(shù)期破骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 取對數(shù)期破骨細(xì)胞，參照Lipofectamine2000試劑說明書分別將miR-187 mimics、miR-con轉(zhuǎn)染至破骨細(xì)胞，分別命名為miR-187組、miR-con組。轉(zhuǎn)染前1 h將培養(yǎng)液更換為不含血清的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含有10%FBS的DMEM新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。同時(shí)將不轉(zhuǎn)染任何基因且正常培養(yǎng)的破骨細(xì)胞作為NC組。

1.2.5qRT-PCR檢測miR-187相對表達(dá)量 取出凍存血清及各組破骨細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA。miR-187正向引物5′-TCGTGGGTCGTGTCTTGTGTTGC-3′，反向引物5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6為內(nèi)參，正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。嚴(yán)格按照qRT-PCR檢測試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，置于ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測，qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。miR-187以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-187相對表達(dá)量。

1.2.6MTT檢測細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后各組破骨細(xì)胞，接種于96孔板，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)每孔加入20 μl MTT溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，勻速振蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔在波長為490 nm處的相對吸光度值(OD)。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組破骨細(xì)胞，0.25%胰酶消化，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108個(gè)/L，預(yù)冷PBS洗滌，加入10 μl濃度為20 mg/L的Annexin V-FITC與5 μl濃度為50 mg/L的PI，室溫避光孵育30 min，置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測各組細(xì)胞凋亡。

1.2.8Western印跡檢測CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax及Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組破骨細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，4℃條件下經(jīng)1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上層清液(蛋白)，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)90 min分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、Notch1、Jagged1、DLL3、Notch2一抗，4℃條件下孵育24 h，TBST洗膜，二抗稀釋液孵育1 h，置于自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，單因素方差分析、Pearson分析；采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血清miR-187對骨質(zhì)疏松性骨折的診斷價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1兩組BMD對比 實(shí)驗(yàn)組BMD為(0.56±0.03)g/cm2，對照組BMD為(0.78±0.12)g/cm2，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩組血清miR-187相對表達(dá)量比較 實(shí)驗(yàn)組血清miR-187相對表達(dá)量明顯低于對照組(1.46±0.51 vs 2.20±0.69;P<0.001)。

2.3血清miR-187與BMD的相關(guān)性 骨質(zhì)疏松性骨折患者血清miR-187與BMD呈正相關(guān)(r=0.357，P<0.05)，見圖1。

圖1 血清miR-187與BMD的相關(guān)性

2.4血清miR-187對骨質(zhì)疏松性骨折的臨床預(yù)測價(jià)值 如圖2所示，血清miR-187用于預(yù)測骨質(zhì)疏松性骨折的ROC曲線下面積(AUC)為0.856，95%CI為0.786～0.926，最佳界值為0.583，敏感度為0.700，特異度為0.883。

圖2 血清miR-187預(yù)測骨質(zhì)疏松性骨折的ROC曲線

2.5miR-187過表達(dá)對破骨細(xì)胞增殖的影響 48、72 h時(shí)miR-187組破骨細(xì)胞的相對吸光度值較NC組、miR-con組顯著降低(P<0.05)，miR-187組CyclinD1 表達(dá)量較NC組、miR-con組顯著降低(P<0.05)，p21蛋白相對表達(dá)量較NC組、miR-con組顯著增加(P<0.05)。表明miR-187過表達(dá)可抑制破骨細(xì)胞增殖。見表2、圖3。

圖3 miR-187過表達(dá)對破骨細(xì)胞增相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6miR-187過表達(dá)對破骨細(xì)胞凋亡的影響 miR-187組破骨細(xì)胞凋亡率較NC組、miR-con組顯著增加(P<0.05)，miR-187組Bax表達(dá)量較NC組、miR-con組顯著增加(P<0.05)，Bcl-2 表達(dá)量較NC組、miR-con組顯著降低(P<0.05)，表明miR-187過表達(dá)可促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡。見表2、圖4、圖5。

圖4 miR-187過表達(dá)對破骨細(xì)胞凋亡的影響

圖5 miR-187過表達(dá)對破骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.7miR-187過表達(dá)對破骨細(xì)胞Notch信號(hào)通路的影響 miR-187組Notch1、Jagged1、DLL3表達(dá)量較NC組、miR-con組顯著增加(P<0.05)；Notch2 表達(dá)量較NC組、miR-con組顯著降低(P<0.05)，表明miR-187過表達(dá)可激活Notch信號(hào)通路。見圖6、表3。

圖6 miR-187過表達(dá)對破骨細(xì)胞Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 miR-187過表達(dá)對破骨細(xì)胞Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

骨吸收量高于骨形成是骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本原因，近年來，研究表明miRNA在成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞活性及分化過程中發(fā)揮重要作用〔11〕。miR-187-3p過表達(dá)可抑制IL-1β等炎癥因子的釋放從而減輕小鼠脊髓缺血再灌注引起的疼痛超敏反應(yīng)〔12〕。研究表明miR-187表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡〔13〕。相關(guān)報(bào)道指出miR-187表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)牛皮癬中角質(zhì)形成細(xì)胞增殖〔14〕。本研究結(jié)果說明隨著骨質(zhì)疏松性骨折患者BMD或骨代謝能力的降低，miR-187的表達(dá)水平顯著降低。提示miR-187表達(dá)水平降低可能促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生及發(fā)展。本研究ROC曲線分析提示血清miR-187可能作為臨床診斷骨質(zhì)疏松患者是否發(fā)生骨折的生物學(xué)指標(biāo)。但miR-187在骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生過程中的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。研究表明破骨細(xì)胞由多個(gè)單核細(xì)胞融合生成，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期在破骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用，CyclinD1與p21是調(diào)控細(xì)胞周期的重要基因，p21可抑制細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，CyclinD1可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)展為S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖〔15〕。本研究顯示miR-187過表達(dá)后破骨細(xì)胞增殖能力顯著降低，提示miR-187過表達(dá)可能通過促使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期從而抑制細(xì)胞增殖。相關(guān)報(bào)道指出破骨細(xì)胞凋亡與Bcl-2、Bax基因表達(dá)密切相關(guān)，Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡，Bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bax表達(dá)水平升高可拮抗Bcl-2對細(xì)胞凋亡的抑制作用〔16〕。本研究結(jié)果顯示miR-187過表達(dá)后破骨細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示miR-187過表達(dá)可通過上調(diào)Bax的表達(dá)及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡。

Notch信號(hào)通路激活后可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及抑制破骨細(xì)胞增殖活性從而防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生〔17〕。Notch1是Notch信號(hào)通路中重要蛋白，研究表明Notch1的表達(dá)水平升高可促進(jìn)Jagged1、DLL3的表達(dá)量升高，同時(shí)破骨細(xì)胞形成數(shù)量明顯減少〔18〕。相關(guān)報(bào)道指出Notch信號(hào)通路由4個(gè)受體與5個(gè)配體組成，其中Notch2、Notch1、Jagged1、DLL3在人類間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)Notch2表達(dá)量與破骨細(xì)胞增殖能力呈正相關(guān)，而Notch1、Jagged1、DLL3表達(dá)量與破骨細(xì)胞增殖能力呈負(fù)相關(guān)〔19，20〕。本研究結(jié)果提示miR-187可能通過增強(qiáng)Notch1信號(hào)通路同時(shí)抑制Notch2信號(hào)通路從而抑制破骨細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。綜上所述，miR-187可抑制破骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過激活Notch1信號(hào)通路，抑制Notch2信號(hào)通路從而抑制破骨細(xì)胞增殖分化，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，減少破骨細(xì)胞存活，可為揭示骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，可為骨質(zhì)疏松的治療提供新方向。