王曉玲，范曉艷，趙鵬濤，曾天文

(1.渭南市中心醫(yī)院,陜西 渭南 714000；2.陜西省康復(fù)醫(yī)院，陜西 西安 710065)

重癥肌無力(Myasthenia Gravis，MG)是一種以神經(jīng)肌肉接頭傳遞功能障礙為特征的自身免疫性疾病，與乙酰膽堿受體(AchR)結(jié)合的抗體引起補體級聯(lián)激活和突觸后膜破壞，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭AChR的丟失，產(chǎn)生依賴T細(xì)胞的抗體的發(fā)展，進而導(dǎo)致耐受機制的崩潰以及骨骼肌無力和疲勞的臨床表現(xiàn)[1]。MG的常用治療方法包括乙酰膽堿酯酶抑制劑、皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑、靜脈免疫球蛋白(IVIG)或血漿置換等[2]。但仍有1/3的患者經(jīng)歷了MG的加重，對標(biāo)準(zhǔn)治療的反應(yīng)很差，與疾病和治療相關(guān)的發(fā)病率仍然很高[3]。輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cells，TFH)及以CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞為特征的T調(diào)節(jié)細(xì)胞(T-regulatorycells，Tregs)是參與體液免疫反應(yīng)的主要T細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病中起著關(guān)鍵作用[4]。因此，重點評價Treg缺陷或功能障礙在MG相關(guān)自身免疫病理中的作用，可能為一種潛在的治療策略。

補充替代醫(yī)學(xué)因其遠(yuǎn)期療效好、副作用少等優(yōu)點，越來越多地被用于治療MG，針灸是最常用的補充醫(yī)學(xué)形式之一[5]。如今，越來越多的MG患者向補充醫(yī)學(xué)和替代醫(yī)學(xué)尋求幫助。針灸作為中醫(yī)的重要組成部分，長期以來一直被用于治療MG疾病，可以緩解患者的癥狀[6]。然而，目前尚無系統(tǒng)評價針刺治療MG的機制。而中醫(yī)具有補脾益損、升陽舉陷治法，在患有自身免疫性疾病的患者中，由于中醫(yī)藥具有有效、廉價且相對安全的特性致使用率上升[7]。補脾強力方由黃芪、黨參、蒼術(shù)、土茯苓、陳皮、丹參、淫羊藿、鎖陽、生地和制附片組成，具有補脾養(yǎng)腎兼以養(yǎng)肝的效果[8]。鑒于針刺治療自身免疫性疾病的研究現(xiàn)狀及補脾強力方的特性，本研究旨在評價針刺聯(lián)合補脾強力方對自身免疫性MG的免疫調(diào)控作用，為MG的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量(240±10)g，8周齡，購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司，使用許可證號：SYXK(川)2018-119，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2019-031。大鼠飼養(yǎng)于恒溫(20～25 ℃)、恒濕(50%±5%)、自然采光和自由飲水條件下，符合《實驗動物管理條例》要求。

1.2 藥物與儀器

大鼠AChR97-116肽購自中國上海中肽有限公司；補脾強力方(黃芪6.6 g，黨參6 g，蒼術(shù)2.2 g，土茯苓4 g，陳皮2 g，丹參3.6 g，淫羊藿1.5 g，鎖陽2.2 g，生地4 g，制附片3.5 g)，中藥配方顆粒，由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)，取相應(yīng)劑量，加入10倍量的水，浸泡8 h后煮沸，提取5 h，將藥液過濾去渣，濾液濃縮至生藥含量為1.5 g/mL；IgG(批號：ZC-37002)、IgA(批號：ZC-37000)、IgM(批號：ZC-37006)、IFN-γ(批號：ZC-36294)及IL-18(批號：ZC-36389)試劑盒購自上海茁彩生物公司；FACSCalibur 流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；TRIzol試劑RNA提取試劑盒(批號：14105)購買自Invitrogen公司(卡爾斯巴德，美國)；PCR擴增試劑盒(批號：AK9906)購買自TaKaRa公司(日本)；CD19(批號：sc-373897)、CD4(批號：sc-19641)相關(guān)抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司(美國)。

1.3 分組與造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為空白組、模型組、補脾強力方組、針刺治療組和針刺聯(lián)合補脾強力方組。通過免疫乳劑的制備構(gòu)建實驗動物模型[7]：首先將鼠源性AchR-α亞基97-116肽段序列(R97-116)、完全弗氏佐劑(CFA)和磷酸緩沖液(PBS)三者按1∶1.5∶1.5的比例充分混勻制成免疫乳劑；首次免疫：取乳劑200 μL(含R97-116：100 μg)于造模鼠足墊、腹部和背部多點皮下注射，空白組皮下注射等量PBS；首次免疫后第30天及第45天，將R97-116、不完全弗氏佐劑(IFA)和PBS三者按1∶3∶3的比例充分混勻制成免疫乳劑后，再取乳劑200 μL(含R97-116：50 μg)加強免疫，空白組注射等量PBS。3次免疫結(jié)束后對大鼠進行肌力評分，按Lennon[9]癥狀分級評分法對大鼠的肌無力癥狀進行評定，評分標(biāo)準(zhǔn)為0級：正常肌力；1級：撕咬無力，四肢力量較差，在光滑地而上前肢打滑，活動減少且易疲勞；2級：明顯無力，體息時身體呈隆起姿勢，頭尾下垂，大腿外展，前肢趾彎曲，動作笨拙，行走不穩(wěn)；3級：嚴(yán)重?zé)o力表現(xiàn)，無撕咬動作，肌肉震，呼吸困難，瀕死或死亡。當(dāng)Lennon癥狀分級評分≥1級，則判定大鼠模型復(fù)制成功。

1.4 治療方法

1.4.1 空白組、模型組 相同條件下飼養(yǎng)，每日抓取，不予其他干預(yù)。

1.4.2 補脾強力方組 每日以10 g/kg補脾強力方灌胃。

1.4.3 針刺治療組 將大鼠固定于柔軟型大鼠固定器上，選取大鼠的手三里、足三里、脾俞和腎俞；除手三里穴直刺5 mm外，其余穴位均直刺6 mm，針刺后行平補平瀉手法，使針下沉緊，操作結(jié)束后在針上加高約1 cm的艾炷，連續(xù)灸3壯，并留針30 min，每日操作1次。穴位定位參照《大鼠穴位圖譜的研制》以及李忠仁版的《實驗針灸學(xué)》[10]。

1.4.4 針刺聯(lián)合補脾強力方組 灌胃補脾強力方+針刺治療，持續(xù)治療21 d。補脾強力方根據(jù)臨床成人劑量換算動物臨床等效劑量為10 g/kg，使用時以蒸餾水配制成所需濃度。

1.5 大鼠肌力評分

大鼠肌力評分，通過重復(fù)抓握練習(xí)進行檢測以及將大鼠放置在平臺上觀察其是否有無力的表現(xiàn)進行臨床評分[11]：0分：力量正常，無異常；1分：輕度活動減少，握力或哭聲較弱，運動結(jié)束時更明顯；2分：運動前出現(xiàn)臨床體征(震顫，頭朝下，駝背，握力弱)；3分：運動前出現(xiàn)嚴(yán)重臨床體征，無握力，奄奄一息；4分：運動結(jié)束時出現(xiàn)臨床體征(震顫，頭朝下，駝背，握力較弱)。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

1.6.1 流式細(xì)胞檢測CD3+、CD4+和CD8+含量 取抗凝血100 μL加入流式測定管中，分別加入5 μL APC標(biāo)記的CD3 McAb及5 μL FITC標(biāo)記的CD4 McAb、5 μL PE標(biāo)記的CD8 McAb后混勻，避光孵育約20 min，加2 mL溶血素，避光孵育約10 min，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，加PBS洗2遍，棄上清液，加入PBS緩沖液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個細(xì)胞/mL，于FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+和CD8+水平。

1.6.2 ELISA檢測血清因子 腹主動脈采血3 mL，分離血清，按照ELISA試劑盒說明檢測血清IgG、IgA、IgM、IFN-γ及IL-18水平。

1.6.3 qRT-PCR檢測胸腺組織IL-10、FOXP3 mRNA表達(dá) 處死大鼠，取胸腺組織，TRIzol?試劑提取樣本總RNA，RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄。嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和相關(guān)引物的說明書加入相應(yīng)量的試劑進行聚合酶鏈反應(yīng)，GAPDH作為內(nèi)參。引物序列：IL-10：上游5′-GCTCAGCACTGCTATGTTGC-3′，下游5′-TGTTGTCC AGCTGGTCCTTC-3′；Foxp3：上游5′-CACCTATGCCACCCTTATCCG-3′，下游5′-CATGCGAGTAAACCAATGGTAGA-3′；GAPDH：上游5′-AGGTCGGTGAAC GGATTTG-3′，下游5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。記錄CT值，采用2-ΔΔCT法分析mRNA相對表達(dá)水平。

1.6.4 WB檢測胸腺組織CD19、CD4蛋白表達(dá) 取胸腺組織，RIPA裂解液提取樣本總蛋白，BCA進行蛋白質(zhì)定量，SDS-PAGE分離，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h，按照實驗?zāi)康慕Y(jié)合一抗CD19、CD4和β-catin4 ℃孵育過夜，隨后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h，TBST清洗，ECL暗室顯色，Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin為內(nèi)參，陰性對照組目標(biāo)蛋白質(zhì)相對含量為1，計算各組蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肌力評分比較

與空白組比較，模型組肌力評分明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與模型組比較，補脾強力方組、針刺治療組和聯(lián)合治療組的肌力評分均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠肌力評分比較

2.2 各組大鼠CD3+、CD4+及CD8+水平比較

與空白組比較，模型組CD3+、CD4+水平明顯升高，CD8+水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，聯(lián)合治療組可明顯降低CD3+水平，補脾強力方組、針刺治療組可明顯降低CD4+水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，補脾強力方組、針刺治療組和聯(lián)合治療組CD8+水平升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠CD3+、CD4+及CD8+水平

2.3 各組大鼠IgG、IgA、IgM及IFN-γ、IL-18水平比較

與空白組比較，模型組IgG、IgA、IgM、IFN-γ及IL-18水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，僅聯(lián)合治療組可明顯降低IgG、IgA、IgM、IFN-γ及IL-18水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠IgG、IgA、IgM及IFN-γ、IL-18水平

2.4 各組大鼠胸腺組織CD19、CD4蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，模型組CD19、CD4蛋白表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，補脾強力方組、針刺治療組和聯(lián)合治療組可明顯降低CD19、CD4蛋白表達(dá)，聯(lián)合治療組效果較佳，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表4、圖2。

表4 各組大鼠胸腺組織CD19、CD4的蛋白表達(dá)

2.5 各組大鼠胸腺組織IL-10、FOXP3 mRNA表達(dá)

與空白組比較，模型組IL-10 mRNA表達(dá)明顯升高，F(xiàn)OXP3 mRNA表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，僅聯(lián)合治療組可明顯降低IL-10 mRNA表達(dá)，明顯升高FOXP3 mRNA表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組大鼠胸腺組織IL-10、FOXP3 mRNA表達(dá)

3 討論

MG是一種具有復(fù)雜發(fā)病機制的獲得性自身免疫性疾病，研究顯示MG主要由致病性抗AChR-Ab引起[1]。在病理條件下，激活的Th細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，進而刺激B細(xì)胞增殖、分化并分泌補體結(jié)合的抗乙酰膽堿受體，最終觸發(fā)膜攻擊復(fù)合物的形成，破壞神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜。因此，AChR表達(dá)的減少阻礙了神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿有效傳遞到適當(dāng)?shù)募?xì)胞[12]。故本實驗通過AChR97-116肽構(gòu)建自身免疫性MG大鼠模型，評價針刺聯(lián)合補脾強力方治療對自身免疫性MG大鼠的免疫調(diào)控作用。

研究證實CD4+T細(xì)胞在MG患者的發(fā)病機制中起重要作用，活化的CD4+T細(xì)胞與合成低親和力抗AChR-Ab的B細(xì)胞相互作用，觸發(fā)IgG基因的體細(xì)胞突變，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生高親和力的抗AChR-Ab，AChR特異性的CD4+T細(xì)胞主要存在于MG患者的胸腺中，許多MG患者在胸腺切除或抗CD4+T細(xì)胞治療后肌肉無力得到緩解[13]。此外，動物實驗表明CD4+T細(xì)胞功能缺陷的小鼠不能誘發(fā)EAMG，分化后的CD4+T細(xì)胞可根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子分為不同的亞群，Th1主要分泌促炎癥細(xì)胞因子，促進補體結(jié)合免疫球蛋白的分泌；Th2主要分泌IL-4和IL-10，可以誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和分化，促進抗體分泌[14]。CD3+可參與T細(xì)胞識別抗原和傳遞信號，而CD8+具有抑制B細(xì)胞生成抗體及降低T細(xì)胞活性等作用，從而抑制體液和細(xì)胞免疫[15]。本研究結(jié)果表明MG大鼠外周血CD3+CD4+T細(xì)胞比例明顯高于空白組，CD8+水平明顯低于空白組；而補脾強力方組、針刺治療組可明顯降低CD4+水平；MG大鼠IgG、IgA、IgM、IFN-γ及IL-18水平較空白組明顯升高；針刺聯(lián)合補脾強力方治療可明顯降低IgG、IgA、IgM、IFN-γ及IL-18水平。提示CD3+CD4+T細(xì)胞參與MG發(fā)病，針刺聯(lián)合補脾強力方治療可有效緩解這一進展。

研究報道MG病情嚴(yán)重程度與外周血淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+GITR+Tregs比例降低呈正相關(guān)[16]。然而一些研究顯示MG患者中沒有CD4+CD25+Treg功能障礙[17]。此外，MG患者存在CD4+CD25+CD127Tregs抑制缺陷，這與IL-6、IL-10、IL-17及IFN-γ水平變化有關(guān)，自身抗體依賴機制被認(rèn)為是各種自身免疫性疾病的重要原因，致病性自身抗體直接或以免疫復(fù)合物的形式作用于自身抗原，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[18]。CD19通過可影響B(tài)淋巴細(xì)胞的活化和分化，CD19缺陷會導(dǎo)致體液反應(yīng)受損，總體上增加感染的易感性，在單次注射抗CD19單抗兩周后，小鼠中的大多數(shù)成熟B細(xì)胞被耗盡，血清IgM、IgG和IgA抗體水平顯著降低[19]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組CD4、CD19蛋白及IL-10 mRNA表達(dá)明顯升高，而FOXP3 mRNA表達(dá)明顯降低；補脾強力方組、針刺治療組和聯(lián)合治療組可明顯降低CD19、CD4蛋白表達(dá)，且聯(lián)合治療組效果明顯。此外，IL-10還作為一種多效性細(xì)胞因子，促進炎癥和自身免疫的發(fā)展。提示CD19、CD4及IL-10在MG發(fā)病機制中的重要作用。此外，對于重癥肌無力的診斷和治療，仍然需要長期甚至終生的治療。本研究實驗表明針刺聯(lián)合補脾強力方可以緩解MG的癥狀，針刺聯(lián)合補脾強力方從中醫(yī)的整體觀念出發(fā)，抓住MG的病機關(guān)鍵，對MG具有良好的治療作用，且中醫(yī)治療可進行長期有效治療，產(chǎn)生的副作用較小。由此，將針刺結(jié)合中醫(yī)藥作為MG的治療方法之一，能夠有效提高MG的治療水平。

綜上所述，針刺聯(lián)合補脾強力方治療可明顯降低自身免疫性重癥肌無力大鼠CD3+CD4+T細(xì)胞及CD19水平，降低免疫球蛋白的分泌，對重癥肌無力具有明顯改善作用。