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        綿羊肺炎支原體內蒙古分離株DnaJ基因克隆表達及其免疫原性研究

        2022-02-14 03:58:40戴伶俐張月梅趙世華達來寶力格
        畜牧與飼料科學 2022年1期
        關鍵詞:綿羊支原體克隆

        戴伶俐,王 娜,劉 威,白 帆,張 帆,張月梅,宋 越,楊 斌,陳 偉,趙世華,達來寶力格

        (內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院,內蒙古 呼和浩特 010031)

        綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)能夠引起綿羊和山羊非典型肺炎。該病臨床上表現為咳嗽、流鼻涕、漸進性消瘦、腹瀉和滲出性間質性肺炎[1],給養(yǎng)羊產業(yè)造成巨大的經濟損失。在我國甘肅、遼寧、四川、新疆、內蒙古等地從患有肺炎的綿羊體內分離到該病原體[2]。近年來,研究人員對內蒙古自治區(qū)羊呼吸道疫病進行了流行病學調查研究及病原分離鑒定工作[3-5],發(fā)現綿羊肺炎支原體是引起綿羊、山羊呼吸道疾病的主要病原體,是嚴重威脅綿羊、山羊健康的重要病原之一。

        熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是細菌在應激條件下產生的一組對細菌自身具有保護作用的蛋白,有助于細菌快速適應環(huán)境,其誘導合成對于病原菌在宿主體內存活至關重要[1,6]。對多種病原菌的研究發(fā)現,熱休克蛋白能夠有效刺激宿主體液免疫和細胞免疫,對病原菌有顯著的免疫保護效應,是較好的疫苗候選蛋白[7-10]。由DnaJ基因編碼的DnaJ蛋白是保守的HSP40家族成員,是熱休克蛋白HSP70分子伴侶蛋白,在多種生理活動和應激反應中發(fā)揮重要作用。近年來,越來越多的研究表明,DnaJ蛋白是細菌的毒力蛋白,具有良好的免疫原性[10-13]。DnaJ蛋白具有黏附—侵襲作用,在病原菌與宿主相互作用過程中發(fā)揮重要作用[12]。

        綿羊肺炎支原體熱休克蛋白HSP70被證明是具有免疫活性的蛋白[9,14-15],但對其伴侶蛋白DnaJ的研究尚屬空白。該研究對綿羊肺炎支原體內蒙古分離株NM03-MO的DnaJ基因進行克隆表達,并對其序列進行分析與預測,初步驗證其表達產物的免疫原性,為綿羊肺炎支原體感染機制研究以及新型疫苗研制提供依據。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 菌株與表達載體

        綿羊肺炎支原體內蒙古分離株NM03-MO,于2017年由內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院獸醫(yī)研究所分離鑒定并保存。pColdⅠ載體由內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院獸醫(yī)研究所保存。

        1.1.2 主要試劑

        細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA marker、質粒小量提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞、大腸桿菌BL21(DE3),購自天根生化科技(北京)有限公司;PrimeSTARHSDNA Polymerase熱啟動高保真聚合酶、pMD19-Tsimple克隆載體、IPTG、氨芐青霉素、瓊脂糖、PCR產物膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;Eco RⅠ、Bam HⅠ限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自NEB(北京)公司;His標簽蛋白純化試劑盒購自碧云天生物科技有限公司;驢抗綿羊IgG(H+L)-HRP抗體購自艾美捷生物科技有限公司。

        1.1.3 試驗動物

        血清制備用綿羊為斷奶小尾寒羊。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 DnaJ基因克隆與測序

        按照細菌基因組提取試劑盒提取支原體NM03-MO株基因組DNA。根據GenBank支原體參考基因組序列,設計DnaJ基因CDS區(qū)PCR擴增引物MO-DNAJ-F(5′-CGCGGATCCGCGGCAAAACAAGATTACTAT-3′)和MO-DNAJ-R(5′-CCGGAATTCCGGTTATTCAAACTCTTTTAG-3′)。以NM03-MO基因組DNA為模板,采用PCR方法擴增DnaJ基因CDS區(qū)。PCR反應體系為50 μL:5×PrimeSTARBuffer 10μL,dNTPMixture(2.5 mmol/L each)4μL,MO-DNAJ-F(10μmol/L)1 μL,MO-DNAJ-R(10μmol/L)1μL,NM03-MO基因 組DNA 1μL,PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5μL,無菌去離子水32.5μL。擴增條件:95℃預變性5 min;95℃變性30 s,設置52、55、58、60℃4個不同退火溫度,優(yōu)化試驗條件,退火時間為30 s,72℃延伸60 s,30個循環(huán);72℃終延伸10 min;4℃保溫。理論PCR擴增片段長度為1 128 bp。PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳,切下目的片段凝膠塊,用PCR產物膠回收試劑盒回收目的片段,按照說明書連接pMD19-Tsimple載體,連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞,挑取陽性克隆菌于氨芐青霉素抗性液體培養(yǎng)基擴增培養(yǎng),按照試劑盒說明書操作提取質粒,經過PCR鑒定,將含有目的片段的陽性克隆質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

        1.2.2 DnaJ蛋白序列分析

        目的片段序列用NCBI在線BLSAT軟件進行初步序列比對。采用DNAstar 7.1.0和Mega7.0軟件將DnaJ基因序列翻譯為氨基酸序列并分析其進化關系。利用生物信息搜索引擎ExPASy中的在線分析軟件ComputepI/Mw(https://web.expasy.org/compute_pi/)和Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)分析和預測蛋白質理論等電點。利用DNAstar 7.1.0中的Protean軟件和Phyre在線分析軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分析和預測蛋白質二級和三級結構。從Uniprot網站(https://www.uniprot.org/)分別下載MO 14811株、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae)ATCCBAA-334株、大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)K12株DnaJ氨 基 酸 序列, 序 列 號 分 別 為A0A014NQY5、P95830、P08622,利用Phyre在線分析軟件預測其三級結構,與分離株NM03-MO對比蛋白質三級結構差異。

        1.2.3 pColdⅠ-DnaJ重組表達載體構建

        選擇經過測序鑒定序列正確的帶有目的片段的克隆載體,使用Eco RⅠ和Bam HⅠ對其進行雙酶切,切膠回收DnaJ基因目的片段,用T4 DNA連接酶將其與經Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切的pColdⅠ線性化載體連接,連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞,挑取陽性克隆菌,提取質粒,進行雙酶切鑒定,完成pColdⅠ-DnaJ重組表達載體構建。

        1.2.4 DnaJ重組蛋白表達與純化

        將pColdⅠ-DnaJ表達載體轉化BL21(DE3)表達感受態(tài)細胞中,經過PCR擴增和酶切鑒定,篩選陽性表達菌株。表達菌經16℃0.5 mmol/L IPTG誘導4 h后收集菌體,加入蛋白純化試劑盒裂解液裂解菌體后,超聲產物4℃12 000 r/min離心10 min,上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳。按照His標簽蛋白純化試劑盒說明書操作,從上清液中提取重組DnaJ蛋白。

        1.2.5 DnaJ重組蛋白免疫原性研究

        利用綿羊肺炎支原體NM03-MO株制備滅活疫苗免疫斷奶綿羊,免疫5周后,ELISA檢測其抗體效價達到1∶3 200以上,頸靜脈采血分離血清,該血清作為Western blot檢測用一抗。重組DnaJ蛋白純化產物和表達菌裂解產物進行Western blot檢測,一抗1∶1 000室溫孵育2 h,用HRP標記的驢抗綿羊IgG抗體作為二抗,1∶5 000稀釋后室溫孵育40 min,ECL顯色。

        2 結果與分析

        2.1 NM03-MO株DnaJ基因克隆測序結果

        以NM03-MO株基因組DNA為模板擴增DnaJ基因片段,PCR退火溫度從52℃到60℃均能夠擴增大小約1 100 bp的特異性目的片段(見圖1),由于退火溫度為60℃條件下擴增目的片段產量低于其他3個溫度條件,擴增效率有所降低,從退火溫度52、55、58℃條件下選擇較高退火溫度以保證PCR擴增特異性,因而選擇58℃為最終PCR退火溫度進行目的片段擴增,切膠回收純化目的片段連接克隆載體pMD19-T載體,構建克隆載體pMD19-DnaJ,并將陽性克隆質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,對插入目的片段測序,結果顯示DnaJ編碼基因全長1 128 bp。

        圖1 綿羊肺炎支原體NM03-MO株DnaJ基因PCR擴增結果

        2.2 NM03-MO株DnaJ氨基酸序列分析結果

        NM03-MO株DnaJ基因編碼376個氨基酸(見圖2),其中包含53個強堿性氨基酸(K、R),42個強酸性氨基酸(D、E),101個親水性氨基酸,116個極性氨基酸。預測分子量為41.65 kDa,等電點9.09。蛋白質二級結構預測分析結果表明DnaJ蛋白具有較強的親水性及抗原性(見圖3)。

        圖2 綿羊肺炎支原體NM03-MO株DnaJ氨基酸序列

        圖3 綿羊肺炎支原體NM03-MO株DnaJ蛋白質二級結構預測分析結果

        對下載的支原體和大腸桿菌DnaJ蛋白序列繪制遺傳進化樹,整體支原體DnaJ共處一個大分支,與大腸桿菌分屬不同進化分支。綿羊肺炎支原體DnaJ與豬支原體親緣關系較近,同屬一個分支(見圖4)。分離株NM03-MO與綿羊肺炎支原體貴州分離株14811株遺傳進化距離最近。

        圖4 DnaJ蛋白序列遺傳進化樹

        分別對綿羊肺炎支原體內蒙古分離株NM03-MO、MO 14811株、S.pneumoniae ATCC BAA-334株和E.coli K12株DnaJ蛋白質序列在線預測其三維結構(見圖5),四者整體結構相似,但在與HSP70相互作用的區(qū)域,如圖5黃色標記區(qū)域所示,綿羊肺炎支原體與大腸桿菌和肺炎鏈球菌的DnaJ結構有一定差異。

        圖5 DnaJ蛋白三維結構預測圖

        2.3 DnaJ重組表達載體構建

        pMD19-DnaJ經過Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切,純化DnaJ基因片段并連接同樣經過Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切線性化的表達載體pColdⅠ,連接轉化并挑取陽性克隆菌擴培后,提取質粒,進行酶切鑒定(見圖6)。質粒雙酶切產物為2條條帶,大片段條帶為載體條帶,約為4 400 bp,小片段條帶為DnaJ目的片段,大小約為1 100 bp;質粒單酶切產物約為5 500 bp,與理論大小相符,成功構建pColdⅠ-DnaJ重組表達載體。

        2.4 DnaJ重組蛋白表達純化

        大腸桿菌BL21(DE3)表達重組DnaJ蛋白,經過條件優(yōu)化,目的蛋白條帶大小約為42 kDa,如圖6箭頭所示,與蛋白質理論大小一致。目的蛋白為上清表達,可直接用鎳柱純化His標簽蛋白(見圖7),由于用His標簽蛋白純化試劑盒粗提靶蛋白,能夠去除大部分非特異性蛋白,但仍存在一定量的非靶蛋白,需要后續(xù)優(yōu)化純化條件,進一步提純靶蛋白用于后續(xù)實驗。

        圖6 p ColdⅠ-DnaJ重組表達載體酶切鑒定結果

        圖7 DnaJ重組蛋白表達純化結果

        2.5 DnaJ重組蛋白免疫原性研究

        為驗證NM03-MO分離株DnaJ重組蛋白是否具有免疫原性,用分離株制備滅活疫苗免疫斷奶綿羊5周后,分離血清,經過Western blot檢測,證明重組DnaJ蛋白能夠與血清抗體結合(見圖8),從而證明了綿羊肺炎支原體DnaJ蛋白能夠在體內刺激機體產生抗體,具有一定的免疫原性。

        圖8 DnaJ重組蛋白Western blot結果

        3 討論

        綿羊肺炎支原體分子致病機制目前已有研究報道[9,16-18],但對其結構蛋白功能研究仍屬于空白,嚴重影響對該疫病的分子致病機制的深入研究及解析,限制了高效特異的診斷方法和疫苗研制。

        對于動物呼吸道疫病病原菌的DnaJ蛋白研究主要集中在對肺炎鏈球菌致病性及抗原保護性等方面。DnaJ缺陷型肺炎鏈球菌感染小鼠,能夠降低小鼠對其天然免疫應答反應強度[19]。豬鏈球菌2型DnaJ蛋白功能與病原菌對溫度敏感性有關,同時與病原菌對宿主細胞的黏附有關,因此,動物或人在感染后體溫持續(xù)升高時,該菌可能通過上調DnaJ蛋白表達,從而提高對宿主細胞的黏附力[20],增強致病性。此外,DnaJ是一類J結構域蛋白,在肺炎支原體末端細胞器也存在J結構域蛋白,該蛋白能夠與HSP70相互作用,影響末端細胞器的形成、支原體滑行運動以及細胞黏附作用[21],存在于肺炎支原體末端細胞器的J結構域蛋白是否就是綿羊肺炎支原體DnaJ蛋白,需要對DnaJ蛋白在MO中的定位深入探討。

        通過黏膜免疫途徑免疫DnaJ抗原可以誘導宿主產生DnaJ抗體,同時刺激宿主提高IL-10、IFN-γ和IL-17A表達水平,可降低肺炎球菌在鼻內或肺臟的定殖。小鼠腹腔或黏膜免疫DnaJ蛋白可激發(fā)小鼠體液免疫和細胞免疫反應,可抵御多種血清型的肺炎鏈球菌感染[22-23],DnaJ蛋白能夠誘導保護性的免疫應答反應,具有作為保守的肺炎鏈球菌蛋白疫苗研制潛力[24]。

        雖然熱休克蛋白和伴侶蛋白在真核和原核生物中的序列較為保守[10],但在不同種屬之間仍然存在一定差異,這種差異也是生物進化形成的一種自保護方式。該研究通過對內蒙古分離株NM03-MO株DnaJ序列克隆測序及其表達蛋白三維結構預測,發(fā)現與綿羊肺炎支原體貴州分離株14811株均存在一定差異,結構差異可能會引起功能性差異,這種結構差異是否與支原體的致病性差異存在一定關系還有待驗證。

        該研究制備的綿羊肺炎支原體DnaJ重組蛋白與綿羊肺炎支原體陽性的綿羊血清有較好的結合活性,也證明該蛋白在宿主體內能激活宿主體液免疫,有較好的免疫原性,但是否能夠刺激機體產生較好的黏膜免疫反應,仍有待研究。

        4 結論

        成功克隆表達綿羊肺炎支原體內蒙古分離株NM03-MO株DnaJ蛋白。重組DnaJ蛋白能夠與血清抗體結合,具有較好的免疫原性,填補了國內外對綿羊肺炎支原體DnaJ蛋白研究的空白,為后續(xù)綿羊肺炎支原體致病機制研究,以及診斷試劑研發(fā)和新型疫苗研制提供試驗支持。

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