賈梓渤，彭健康，朱 燕，陳海峰，王 婧

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

奶牛乳房炎通常是由于病原菌感染、外界損傷或奶牛機(jī)體免疫力降低導(dǎo)致的奶牛乳腺的實(shí)質(zhì)和間質(zhì)性炎癥［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有大約34%的奶牛患有各種類型的乳房炎［2］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)奶牛乳房炎的感染率高達(dá)70%，46.4%～85.7%為隱性乳房炎［3］。因此，乳房炎作為奶牛三大常見(jiàn)疾病之一成為困擾養(yǎng)殖戶的難題，嚴(yán)重制約了奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

奶牛乳房炎的發(fā)病原因較多，一般由病原微生物感染、胎次、飼喂環(huán)境、飼養(yǎng)管理水平、奶牛自身免疫力等因素綜合影響［4］。根據(jù)炎癥的嚴(yán)重程度，可將乳房炎分為臨床型和隱性型，隱性型乳房炎是指在臨床體征上無(wú)明顯的變化，但對(duì)奶的質(zhì)量和產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響［5］。通常認(rèn)為病原微生物感染是引起奶牛隱性乳房炎的主要因素，常見(jiàn)病原微生物包括大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等，以及一些支原體、真菌等，又以金黃色葡萄球菌為主［6］。

金黃色葡萄球菌主要通過(guò)皮膚和口咽部入侵機(jī)體，隨后定植于乳腺上皮細(xì)胞，損傷奶牛的乳腺組織，引起隱性和慢性乳房炎［7］。由于金黃色葡萄球菌侵入病牛乳房后，被炎癥組織包圍，抗菌藥物不易到達(dá)損傷部位，導(dǎo)致耐藥菌株逐年增加，因此，一旦侵入牛群便很難被根除［8］。金黃色葡萄球菌引發(fā)的乳房炎一般呈慢性過(guò)程。急性感染相對(duì)較少，但是一旦感染，該病原菌就會(huì)在乳腺組織中大量繁殖，造成動(dòng)物反復(fù)感染，并在牛群之間連續(xù)傳播。在該病原菌繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的一系列毒素因子，也可引起急性壞疽性乳房炎［3，9］。

該研究主要針對(duì)江蘇省泰州市某奶牛場(chǎng)中奶牛乳房炎奶樣進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離、鑒定及藥敏測(cè)試，為該奶牛場(chǎng)乳房炎的預(yù)防和治療用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Taq DNA聚合酶、DNA Marker 2 000、DNA提取試劑盒等均購(gòu)自TAKARA生物公司；血平板、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)、亞碲酸鉀卵黃增菌劑、生化鑒定管、凍干血漿購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)液和瓊脂、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、血平板、藥敏紙片購(gòu)自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.2 樣品采集

2020年12月，于江蘇省泰州市某奶牛場(chǎng)采集乳房炎奶樣共9份。

1.3 細(xì)菌分離

將采集的奶樣置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，振蕩培養(yǎng)4 h左右，用滅菌棉簽蘸取少量奶樣均勻涂布于Baird-Parker平板中，37℃培養(yǎng)24 h。挑取黑色、有光澤性的疑似菌落，再次劃線接種至TSA平板中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單個(gè)黃色菌落至肉湯中增菌用于鑒定。

1.4 細(xì)菌的鑒定

1.4.1 革蘭染色鏡檢

取少量菌液與滅菌水于載玻片上混勻，采用革蘭染色進(jìn)行染色鏡檢。

1.4.2 生化鑒定試驗(yàn)

取純化的疑似菌株，接種于細(xì)菌微量生化鑒定管進(jìn)行生化鑒定。接種后置于37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜，次日觀察結(jié)果。

1.4.3 溶血性試驗(yàn)

用接種環(huán)蘸取少量上述純培養(yǎng)肉湯，采用分區(qū)劃線法將菌落接種于血平板中，放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。

1.4.4 血漿凝固酶試驗(yàn)

在凍干兔血清中加入0.5 mL滅菌生理鹽水至完全溶解，再加入0.3 mL疑似菌落的肉湯培養(yǎng)液混勻，置于37℃培養(yǎng)5 h。觀察結(jié)果時(shí)將西林瓶?jī)A斜或倒置，內(nèi)容物不流動(dòng)則判為陽(yáng)性，反之則為陰性，以不接菌的肉湯作陰性對(duì)照。

1.4.5 PCR鑒定

取500μL新鮮疑似菌液放入指形管，加熱煮沸5 min，以此為模板，參考文獻(xiàn)［10］進(jìn)行16SrDNA和nuc基因片段的PCR擴(kuò)增，并經(jīng)1.5%電泳檢測(cè)，將nuc基因檢測(cè)為陽(yáng)性的菌株擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn)

使用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，隨后按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)抑菌圈直徑判斷結(jié)果，重復(fù)3遍［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為灰黑色，有光澤，邊緣淺色，周圍有不透明的圓圈，外有一清晰帶。挑取灰黑色或黑色疑似菌落再次接種至TSA培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落接種于血平板，有溶血現(xiàn)象（見(jiàn)圖1）；染色鏡檢發(fā)現(xiàn)所有菌株呈葡萄串狀樣或短鏈樣排列的革蘭陽(yáng)性球菌，共篩選出6株（分別編號(hào)為20210315D1、20210315D2、20210315D3、20210315 D4、20210315D5、20210315D6。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行劃線分離、純化（見(jiàn)圖2）。

圖1 分離菌的溶血性

圖2 分離菌的純化

2.2 金黃色葡萄球菌的生化鑒定

將疑似菌株接種至微量生化鑒定管培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》確定6株細(xì)菌均屬于葡萄球菌屬。由于金黃色葡萄球菌致病菌多能分解甘露醇，產(chǎn)生凝固酶，因此，重點(diǎn)對(duì)這兩個(gè)生化指標(biāo)進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。結(jié)果顯示，共有3株分離 菌 （分 別 編 號(hào) 為20210315D1、20210315D2、20210315D3）表現(xiàn)為甘露醇分解（見(jiàn)圖3）和血漿凝固酶均為陽(yáng)性（見(jiàn)圖4），表明分離到致病性的金黃色葡萄球菌。

圖3 甘露醇試驗(yàn)

圖4 血漿凝固酶試驗(yàn)

2.3 金黃色葡萄球菌的PCR鑒定

nuc為金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因，具有高度保守的特性，該試驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)［10］進(jìn)行了nuc和16SrDNA片段的擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。將3株nuc基因擴(kuò)增為陽(yáng)性的菌株P(guān)CR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。對(duì)16SrDNA序列的BLAST比對(duì)分析表明，結(jié)果與甘露醇和血漿凝固酶試驗(yàn)一致，3株均為金黃色葡萄球菌。

圖5 nuc PCR結(jié)果

圖6 16S r D NA PCR結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)一步對(duì)分離到的金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥物敏感性測(cè)試。試驗(yàn)共采用18種藥敏紙片，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，3株臨床分離的金黃色葡菌球菌均對(duì)青霉素G耐藥；有2株菌對(duì)四環(huán)素耐藥；2株菌對(duì)紅霉素和苯唑西林表現(xiàn)為中介，其余均為敏感。

表1 金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果

3 討論

引起奶牛乳房炎的病原種類復(fù)雜多樣，臨床上多數(shù)奶牛乳房炎是由葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌引起的。張崢臻等［12］對(duì)上海地區(qū)2009—2010年隱性乳房炎病原流調(diào)結(jié)果也顯示，病原菌以凝固酶陰性葡萄球菌為主，其次為金黃色葡萄球菌。周國(guó)燕等［13］從四川地區(qū)乳腺炎奶樣中分離到的病原菌主要有葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌和鏈球菌等。劉肖利等［14］從采自新疆等地的142份乳房炎樣品中分離到5株金黃色葡萄球菌。張楠等［15］從邯鄲地區(qū)采集的31份臨床型奶牛乳房炎奶樣中分離到金黃色葡萄球菌9株。試驗(yàn)采用特異性顯色培養(yǎng)基對(duì)隱性乳房炎奶樣中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行分離、純化和微生物生化鑒定，并結(jié)合16SrDNA PCR測(cè)序從9份隱性乳房炎奶樣中分離到6株葡萄球菌，其中3株為金黃色葡萄球菌，表明該奶牛場(chǎng)中存在金黃色葡萄球菌的感染，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)飼養(yǎng)管理并注意奶牛場(chǎng)的衛(wèi)生狀況。

進(jìn)一步對(duì)分離到的金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏分析發(fā)現(xiàn)，3株分離菌均對(duì)青霉素G耐藥，其中2株對(duì)四環(huán)素耐藥，這2種為常用的廣譜抗生素，有報(bào)道稱目前全球范圍內(nèi)有90%～95%的金黃色葡萄球菌耐青霉素［16］，這也和國(guó)內(nèi)一些報(bào)道一致［17-18］。有2株對(duì)紅霉素和苯唑西林表現(xiàn)為中介，其余為敏感，為該奶牛場(chǎng)預(yù)防和治療奶牛乳房炎合理選擇抗生素提供了理論依據(jù)。