郁桂聰鄭豪蕾王曉倩何致民高 娟

(濟南大學生物科學與技術學院,山東 濟南 250022)

0 引言

果膠是一類結構不均一的多糖,廣泛存在于高等植物細胞壁的中間層。果膠主要由半乳糖醛酸(Gal A)通過α-1,4-糖苷鍵連接而成[1],包括聚半乳糖醛酸(HG)、聚鼠李半乳糖醛酸-I(RG-I)和聚鼠李半乳糖醛酸-II(RG-II)三種結構域單元[2,3]。果膠在食品、醫(yī)藥和精細化學等工業(yè)中具有廣泛應用[4,5]。近年來的研究表明,果膠的降解產物具有良好的理化性質,作為食品添加劑,藥物和化妝品材料具有廣闊的應用前景[6,7]。

果膠的降解需要一系列果膠酶的協(xié)同作用。根據催化機制不同,果膠酶可分為三類:果膠解聚酶、果膠酯酶和果膠裂解酶[8,9]。其中,果膠酸裂解酶(Pectate lyase,PL,EC 4.2.2.2)斷裂果膠HG 結構域中的α-1,4-糖苷鍵,從C-5位消去一個H 原子,在非還原端產生含有不飽和半乳糖醛酸殘基的寡聚糖[10]。不同來源的果膠酸裂解酶對酸堿耐受性不同。由于果膠在堿性溶液中顯示出更好的溶解性,因此堿性果膠酸裂解酶展現出更好的應用前景[11,12]。

果膠酸裂解酶被廣泛應用于工業(yè)生產,如果蔬汁的萃取與純化、苧麻纖維脫膠、果膠廢水的處理等領域[13,14]。迄今為止,果膠酸裂解酶已經從各種微生物中分離出來。芽孢桿菌屬細菌是微生物果膠裂解酶的主要來源之一[15,16]。本實驗室的前期研究表明,多粘類芽孢桿菌的基因組中含有4個果膠酸裂解酶編碼基因。對多粘類芽孢桿菌的果膠酸裂解酶Pp Pel10a的研究表明:該酶能夠有效降解柑橘果膠,產物主要為不飽和的單半乳糖醛酸和低聚半乳糖醛酸。Pp Pel10a單獨處理或Pp Pel10a-氫氧化鈉聯(lián)合處理苧麻纖維,苧麻纖維失重明顯[17]。因此,該酶在果汁澄清和植物纖維加工中有潛在的應用前景。但是,PpPel10a的酶活和穩(wěn)定性易受外界因素如堿性p H 和高溫的影響,不利于其在工業(yè)生產中的應用。

固定化可以提高酶的使用效率和穩(wěn)定性,并能降低酶的應用成本[18],為提高果膠酸裂解酶的穩(wěn)定性提供了可能的解決途徑[19]。戊二醛交聯(lián)法是一種比較常用的酶固定化方法。交聯(lián)劑的選擇及交聯(lián)條件對固定化酶的回收率和穩(wěn)定性影響較大[20,21]。因此,在本研究中,利用單因素試驗與響應面試驗對殼聚糖交聯(lián)固定Pp Pel10a的條件展開優(yōu)化,并利用固定化Pp Pel10a進行苧麻纖維脫膠實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組果膠酸裂解酶(Pp Pel10a):本實驗室從多粘類芽孢桿菌中克隆并在大腸桿菌BL21(DE3)中重組表達[17];苧麻韌皮購自淘寶;多聚半乳糖醛酸(PGA)購買自上海源葉生物;50%戊二醛:天津市大茂化學試劑廠;其它試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白含量測定。以牛血清白蛋白(25～500μg/m L)為標準品,利用BCA 法繪制蛋白質含量標準曲線。根據標準曲線y＝0.8149x＋0.2247(R2＝0.9954,x軸為BSA 的濃度,mg/m L;y軸為A562)計算游離酶和固定化酶的蛋白質含量。

1.3.2 固定化PpPel10a的制備。將3 g殼聚糖溶于100 m L的2%乙酸溶液中制備成3%的殼聚糖溶液,用1 m L注射器吸取該溶液滴入乙醇:NaOH 溶液(1:4,v:v)中,4 ℃條件下硬化4 h。然后用去離子水沖洗殼聚糖小球,直至呈p H 中性,抽濾干燥。置入10 m L 3%戊二醛中,25℃振蕩交聯(lián)過夜。稱取0.1 g殼聚糖小球載體,加入0.6 mg純化的重組Pp Pel10a,30℃振蕩吸附3 h,然后4℃靜置14 h,去離子水洗滌,抽濾干燥后即得固定化酶,4 ℃儲存用于后續(xù)實驗。

1.3.3 果膠酸裂解酶活性測定。將0.7μg純化酶或0.1 g固定化酶小球加入到2 m L 含有0.2%PGA 的Gly-NaOH 緩沖液中(50 mmol/L,p H 9.0),50 ℃反應15 min后,測定235 nm 處的吸光度。1 個酶活單位(U)定義為在上述條件下,每分鐘使235 nm 波長處吸光度增加0.01所需的酶量[22]。固定化酶的酶活回收率＝(酶總活力-游離酶活力)/酶總活力×100%。

1.3.4 固定化條件優(yōu)化。

(1)單因素試驗。通過控制變量確定各因素對固定化效果的影響。變量設置條件:殼聚糖濃度分別為2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%;戊二醛濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%;游離酶添加量:每0.1 g殼聚糖小球分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mg純化的重組Pp Pel10a;吸附時間:1、2、3、4、5、6 h;吸附溫度:10、15、20、25、30、35、40 ℃。固定化方法如1.2.2所示。

(2)Plackett-Burman實驗。在單因素試驗的基礎上,通過Plackett-Burman試驗確定影響固定化效率的主要因素。利用Design-Expert 8.0軟件設計N＝12的5因素2水平的Plackett-Burman試驗[23],各因素的編碼水平見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗因素水平編碼表

(3)最陡爬坡試驗設計。根據Plackett-Burman試驗得出三個影響酶活的顯著因素,設計這三個因素的最陡爬坡路徑,爬坡方向根據實驗數值變化的梯度方向確定[24]。

2.廣泛調查測評對象。一是調查企業(yè)生產經營與科技創(chuàng)新計劃，分析出企業(yè)急需解決的問題，把握培訓需求；二是從企業(yè)各部門了解和搜集生產、安全、成本等有關數據及情況，從中發(fā)現哪些需要人才開發(fā)的支持；三是對企業(yè)和職工進行調查，從中確定需要哪種培訓；四是對全體參加培訓的職工，了解他們對培訓的內容、培訓形式、培訓技巧等有哪些基本的要求，使培訓的需求調查得到可靠的結論。

(4)響應面分析優(yōu)化。根據Box-Behnken試驗與最陡爬坡試驗結果,運用軟件Design-Expert 8.0設計Box-Behnken實驗[25],響應面水平見表2。使用MINITAB 16.0軟件對試驗數據進行處理分析[26]。

表2 響應面各因素及水平

(5)最優(yōu)條件驗證試驗。按照響應面法試驗數據得到最優(yōu)的Pp Pel10a固定條件進行三次重復驗證,按照1.2.3的方法測定固定化Pp Pel10a的酶活,取平均值與預測值比較。

1.3.5 固定化酶和游離酶的酶學性質比較。(1)最適p H 測定。將游離酶或固定化酶在p H 2.0～11.0的緩沖液中,加入PGA 底物后,50 ℃反應,按照1.2.3的方法分別測定游離酶和固定化酶的酶活。所用緩沖液為:Na AC緩沖液(50 mmol/L,p H 2.0～6.0),磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L,p H 6.0～8.0),Gly-NaOH 緩沖液(50 mmol/L,p H 8.0～11.0)。(2)p H 穩(wěn)定性測定。將游離酶和固定化酶分別置于p H 2.0～11.0的緩沖液中,室溫放置20 h,按照1.2.3的方法分別測定游離酶和固定化酶的酶活。所用緩沖液如1.2.5.1所示。(3)最適溫度測定。將游離酶和固定化酶置于20～80 ℃,按照1.2.3的方法分別測定游離酶和固定化酶的酶活。以最高的酶活力定義為100%。(4)溫度穩(wěn)定性測定。將游離酶和固定化酶分別置于60、70 ℃水浴鍋中保溫60 min,在此期間間隔取樣,按照1.2.3的方法分別測定游離酶和固定化酶的酶活。未保溫測定的酶活記為100%。(5)操作穩(wěn)定性。將固定化酶按照1.2.3的方法連續(xù)操作10次,測定相對酶活。以第一次的酶活定義為100%。

1.4 固定化Pp Pel10a處理苧麻纖維

稱取2.0 g苧麻纖維,水煮10 min,分別用以下方法處理。陰性對照:50 mmol/L甘氨酸-Na OH 緩沖液(p H 9.0);酶法:固定化Pp Pel10a微球0.5 g。各實驗組在50℃、100 r/min條件下振蕩反應4 h。處理后的樣品用去離子水清洗,干燥后失重,記錄損失重量,并用SEM 觀察苧麻纖維的表面。苧麻脫膠的失重率(%)＝苧麻損失重量/原苧麻重量?100%[27,28]。

1.5 數據處理

每組實驗進行三次平行實驗,實驗結果以平均值±標準差表示,并用SPSS Statistics 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析[28]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 殼聚糖濃度對固定化Pp Pel10a效果的影響。殼聚糖的濃度對固定化酶的酶活回收率至關重要。如圖1所示,在2%～3%范圍內,隨著殼聚糖濃度增加,固定化PpPel10a的酶活逐步升高,在3%濃度時酶活最高。隨著殼聚糖濃度繼續(xù)升高,Pp Pel10a酶活大幅下降。推測是由于殼聚糖濃度低于3%時,殼聚糖小球呈橢圓形,球表膜機械強度差,易形變。而殼聚糖濃度大于3%時,殼聚糖小球出現拖尾現象,剛性過強,易碎。在殼聚糖濃度為3%時,殼聚糖小球呈規(guī)則圓球形,機械強度良好,不易形變。因此,殼聚糖的濃度影響固定化小球的形狀和機械強度從而對固定化酶的酶活回收率產生影響。

圖1 殼聚糖濃度對固定化酶活性的影響

2.1.2 戊二醛濃度對固定化Pp Pel10a效果的影響。戊二醛作為一種雙官能團交聯(lián)劑,對蛋白質的交聯(lián)效果較好。戊二醛濃度對固定化酶活性的影響見圖2。當戊二醛濃度小于4%時,固定化效果隨著戊二醛濃度增加而提高,高于4%濃度的戊二醛使固定化效果開始下降。原因可能是高濃度戊二醛導致Pp Pel10a變性失活,另一種原因可能是戊二醛濃度過高時,造成小球表面孔隙過大,導致固定化酶容易流失,造成固定化效果下降。

圖2 戊二醛濃度對固定化酶活性的影響

2.1.3 游離酶添加量對固定化PpPel10a效果的影響。游離酶添加量對固定化酶活性的影響見圖3。當添加量在2～8 mg·g－1范圍內,固定化效果隨著酶量增加而提高,固定化效果顯著上升。當添加量在大于8 mg·g－1時,此時載體上的蛋白結合位點達到飽和,從而導致酶分子的相互聚集,使得固定化效果下降。

圖3 酶濃度對固定化酶活性的影響

2.1.4 吸附時間對固定化Pp Pel10a效果的影響。吸附時間對固定化酶活性的影響見圖4。吸附時間為5 h時固定化效果最好,從5 h開始出現下降趨勢。分析原因可能是時間過長導致酶失活;另一個原因可能是已經固定化的酶向外擴散,造成酶量減少,使固定化效果降低。

圖4 吸附時間對固定化酶活性的影響

2.1.5 吸附溫度對固定化Pp Pel10a效果的影響。吸附溫度一方面影響吸附效率,另一方面影響酶的穩(wěn)定性。由圖5可知,吸附溫度在30 ℃時固定化Pp Pel10a的酶活最高,高于或低于30℃導致Pp Pel10a的固定化效果較差。

圖5 吸附溫度對固定化酶活性的影響

2.2 固定化條件的優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman試驗設計篩選顯著影響因素。根據表1實驗因素的水平,使用Design-Expert 8.0設計N＝12的5因素2水平Plackett-Burman實驗,驗證上述五種因素對固定化效果影響是否顯著。酶活結果及各因素的顯著性水平分別見表3和表4。由結果可知殼聚糖濃度、戊二醛濃度以及游離酶添加量這三項因素對Pp Pel10a固定化的酶活影響較大(P＜0.05),接下來對這三個因素進行進一步優(yōu)化。

表3 Plackett-Burman實驗結果

表4 Plackeet-Burman試驗設計的因素水平及效應分析

2.2.2 最陡爬坡試驗。分析表4的PB試驗結果可知,殼聚糖濃度和游離酶添加量的T 值為正值,顯示這兩個因素對PpPel10a的固定化具有正效應,按遞增模式設計爬坡路徑;戊二醛濃度的T 值為負值,表明其對Pp Pel10a的固定化具有負效應,按遞減模式設計(表5)。由最陡爬坡試驗結果可知,第3組為最佳因子組合,實驗條件為:殼聚糖濃度(X1)3.5%,戊二醛濃度(X2)3%,游離酶添加量(X3)為8 mg·g－1。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果

2.2.3 響應面實驗優(yōu)化固定化條件。(1)Box-Behnken試驗。根據最陡爬坡實驗結果,以殼聚糖濃度、戊二醛濃度、游離酶添加量三者為自變量,PL酶活為響應值,設計N＝17的3因素3水平的Box-Behnken試驗。PL酶活結果如表6所示。(2)回歸方程的建立及顯著性。根據Box-Behnken實驗結果,經Design-Expert 8.0軟件分析,確定影響固定化效果的二次回歸方程:PL 酶活(U·mg－1)＝6716.18 ＋22.63X1－36.90X2＋274.63X3－195.25X1X2＋878.55X1X3－ 254.75X2X3－ 1117.62X12－ 441.42X22－ 1100.96X32。其中X1、X2和X3分別代表殼聚糖濃度、戊二醛濃度和游離酶添加量的編碼水平?；貧w方程方差分析顯著性檢驗結果表明:該模型的P值＜0.01(P＝0.0002),失擬項的P值＞0.05(P＝0.0877),說明該的模型失擬不顯著,回歸顯著,能夠用來對固定化酶的酶活性進行預測。一次項X3、二次項X22與交互項X2X3對固定化酶活性影響顯著,二次項X12、X32與交互項X1X3對固定化酶活性影響極顯著。其余均不顯著?；貧w模型的決定系數為0.9696,說明該模型很好地反應了固定化酶的酶活與殼聚糖濃度、戊二醛濃度和游離酶添加量之間的關系,且實驗誤差較小,并具有良好的擬合程度。(3)響應面分析及最優(yōu)條件確定。利用Design-Expert 8.0繪制響應面分析圖(圖6)。由響應面圖可以看出:殼聚糖濃度(X1)、戊二醛濃度(X2)、游離酶添加量(X3)三個因素兩兩之間存在交互作用。結合各因素交互作用對固定化酶活性影響的響應面圖和回歸模型,當殼聚糖濃度(X1)、戊二醛濃度(X2)、游離酶添加量(X3)分別為3.5%、3%、8 mg·g－1時,預測固定化效果達到最佳,其PL酶活響應值為6733.3 U·mg－1。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果

表7 二次方模型響應面方差分析

圖6 各因素交互作用影響果膠酸裂解酶固定化的響應面圖

利用分析得出的最佳條件因素進行模型驗證,三次平行實驗得到酶活數值分別為6685.7、6742.9、6761.9 U·mg－1,與理論值6733.3 U·mg－1相比偏差極小,表明該模型可信度高。在此條件下,計算固定化Pp Pel10a的酶活回收率為87.3%。

2.3 固定化酶的酶學性質

2.3.1 最適p H 與p H 穩(wěn)定性。游離狀態(tài)下,PpPel10a的最適p H 為9.0,經過固定化后,PpPel10a的最適p H 遷移到10.0(圖7)。堿性果膠酸裂解酶適用于果膠質的降解,具有較好的應用價值。

圖7 固定化酶與游離酶的最適p H 結果

將固定化酶和游離酶放置于不同p H 緩沖液中孵育24 h后,測定其酶活力,結果如圖8所示。當p H 值達到11.0時,固定化酶的殘留活性仍能達到70%,而游離酶活性僅殘留50%左右,說明經過固定化后,提高了游離的PpPel10a在近堿性條件下的作用效果。

圖8 固定化酶與游離酶的p H 穩(wěn)定性結果

2.3.2 最適溫度與溫度穩(wěn)定性。如圖9所示,固定化PpPel10a與游離狀態(tài)的PpPel10a的最適反應溫度均為50℃。超過50℃后,二者的相對酶活性均隨溫度的提高而降低,在同一溫度下,固定化PpPel10a的酶活均高于游離酶。

圖9 固定化酶與游離酶的最適溫度測定

將固定化酶與游離酶置于60 ℃或70 ℃下孵育一段時間,檢測其殘余活性。如圖10所示,70 ℃條件下孵育1 h,游離酶僅剩約20%的酶活,但固定化酶的酶活仍保留70%以上。此外,在同一溫度下,固定化酶的相對酶活力較游離酶下降的慢。綜上所述,固定化PpPel10a的熱穩(wěn)定性較游離酶有所提高。

圖10 固定化酶與游離酶的熱穩(wěn)定性

2.3.3 操作穩(wěn)定性。固定化酶的使用次數反映其在工業(yè)領域的應用潛力?？芍貜褪褂么螖翟蕉?該酶的應用潛力越大。如圖11所示,隨著使用次數的增加,固定化Pp Pel10a的酶活逐步降低。重復使用7次后,PpPel10a的酶活仍殘留30%以上,這表明殼聚糖固定化后的PpPel10a重復利用率較高。

圖11 固定化酶的操作穩(wěn)定性測定

2.4 固定化PpPel10a處理苧麻纖維

果膠酸裂解酶可用于苧麻纖維的脫膠過程。前期研究表明,游離的Pp Pel10a在苧麻纖維脫膠過程中發(fā)揮了良好的作用。但因為苧麻纖維脫膠過程一般在堿性條件下進行,對果膠酸裂解酶的p H 穩(wěn)定性要求較高,游離酶無法滿足這一需求。在此,利用固定化PpPel10a進行苧麻纖維脫膠。與對照組相比,固定化Pp Pel10a處理苧麻纖維后,苧麻重量損失達20.2% ±2.3%,遠高于對照組(10.1% ±0.9%)。脫膠后的苧麻纖維形態(tài)觀察表明固定化酶處理比單獨緩沖液處理,苧麻纖維更加柔軟、潔白(圖12(a、b)),SEM 掃描發(fā)現表面更加光滑(圖12(c、d)),說明該固定化酶在苧麻纖維脫膠中具有潛在的應用價值。

圖12 固定化PpPel10a處理苧麻纖維(a)對照組苧麻纖維形態(tài);(b)固定化PpPel10a處理后的苧麻纖維后形態(tài);(c)苧麻纖維SEM 掃描;(d)SEM 掃描觀察固定化PpPel10a處理的苧麻纖維;SEM 放大倍數為500

3 結論

殼聚糖是一種幾丁質脫乙酰產物,在食品行業(yè)已經得到了廣泛應用,具有較高的安全性和蛋白吸附能力。因此本文采用殼聚糖作為固定化酶載體,并通過實驗測得固定化果膠酸裂解酶Pp Pel10a的最優(yōu)條件為:殼聚糖濃度3.5%、戊二醛濃度3%、酶濃度8 mg·g－1、吸附時間5 h、吸附溫度30 ℃。在此優(yōu)化條件下固定化酶PpPel10a的酶活回收率為87.3%。固定化PpPel10a較游離酶相比,最適p H 向堿性p H 偏移,且固定化后的Pp Pel10a的熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性較游離酶相比均有所提高。固定化酶重復使用7次后殘留酶活力仍有30%,說明該酶具有較好的工業(yè)生產潛力。利用固定化Pp Pel10a處理苧麻纖維,通過電子顯微鏡掃描發(fā)現,酶處理獲得的纖維表面更加平滑且纖維分散度較高。本研究為固定化果膠酸裂解酶在紡織工業(yè)中的應用奠定了試驗基礎。