高曉潔,白明學,桂新景,王艷麗,王君明,姚 靜,張 璐,施鈞瀚,李學林,劉瑞新*
基于苦味閾值濃度的藥物分子苦度定量方法研究
高曉潔1,白明學1,桂新景2, 3, 4, 5, 6,王艷麗2, 3, 4, 5, 6,王君明3,姚 靜2, 3, 4, 5, 6,張 璐2, 3, 4, 5, 6,施鈞瀚2, 3, 4, 5, 6,李學林2, 3, 4, 5, 6,劉瑞新2, 3, 4, 5, 6*
1. 鄭州市中醫(yī)院 制劑室,河南 鄭州 450007 2. 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 藥學部,河南 鄭州 450000 3. 河南中醫(yī)藥大學,河南 鄭州 450008 4. 河南省中藥飲片臨床應用現(xiàn)代化工程研究中心,河南 鄭州 450000 5. 河南中醫(yī)藥大學 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 鄭州 450000 6. 河南省中藥臨床藥學中醫(yī)藥重點實驗室,河南 鄭州 450000
建立僅與藥物分子屬性有關的藥物分子苦度(molecule bitterness,MB)的定量方法。采用口嘗法,以鹽酸小檗堿為標準苦味物質,以不同濃度的鹽酸小檗堿、奎寧、苦參堿、延胡索乙素、穿心蓮內酯、梔子苷、葛根素、柚皮苷、-精氨酸、熊果苷、益母草堿、檸檬苦素、獐牙菜苦苷、蘆薈苷、龍膽苦苷、鹽酸青藤堿、氧化苦參堿、京尼平苷、槐定堿的水溶液為載體,采用“最小極限法”預測苦味閾值濃度(bitterness threshold concentration,BTC),并基于此計算其MB;以鹽酸小檗堿、苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內酯、葛根素的水溶液為載體,采用電子舌測得不同濃度溶液的響應值,基于口嘗法測得的鹽酸小檗堿的BTC,預測其他4種苦味單體的BTC,進而預測其MB。采用口嘗法,測得感知到苦味的人數(shù)比例與苦味單體的濃度之間符合威布爾曲線關系,然后由擬合的曲線計算出BTC,進而測得了19種苦味單體的MB;在BTC試驗的測定范圍內,電子舌傳感器僅對鹽酸小檗堿和苦參堿的測定得到有效數(shù)據(jù),但對其產生響應的傳感器不同,不同傳感器之間信息相互獨立,基于電子舌未能得到苦參堿的BTC。采用口嘗法建立了基于BTC的MB的測定方法,并測定出19種苦味單體的MB;雖未能建立基于電子舌的MB預測方法,但是為后續(xù)苦度定量方法研究提供借鑒。
最小極限法;苦味閾值濃度;分子苦度;口嘗法;電子舌;鹽酸小檗堿;苦參堿
長久以來,人們對藥物苦味的評價多是通過定性的描述來表達,如無法忍受的苦、有點苦、幾乎沒有苦味等,缺乏對其客觀定量的表達。已有的藥物苦度定量方法多存在測量標準不統(tǒng)一、適用范圍窄等問題,沒有一套科學、可行、規(guī)范的測試體系,這對開展藥物的掩味研究是非常不利的。因此,采用一定的方法對藥物苦度進行測量,使其可以用準確的數(shù)學指標進行表達,是非常必要的。
在食品領域,人們曾嘗試定量測定苦度。如常通過計算所含全部異構化α-酸(啤酒苦味的主要來源)的量來測定啤酒的苦度,其表示方式有歐洲苦度單位(Europe bitterness units,EBU)[1-2]、國際苦度單位(international bitter units,IBU)[3]等。然而,在藥學領域,尤其在中藥學領域,由于苦味成分復雜,通過計算單位體積內某種特定苦味成分含量的方法,很難應用于藥物的苦度測量。
味道的產生,本質上是物質分子溶于唾液,與舌頭上的味蕾受體相結合,產生不同的電信號,從而感應出不同的味道。1972年Kier對甜味AH/B系統(tǒng)理論進行了擴展,提出著名的AH,B,X甜味三角理論。即A和B是空間相距0.25~0.40 nm的帶負電荷的2個原子,其中A與帶正電的質子結合成為AH,AH在整體上可認為是酸,B為質子受體,可認為是堿,而X為疏水(親油)結合基團,該基團在與AH、B分別相距0.35 nm和0.55 nm的地方與二者構成AH,B,X甜味三角形(生甜團)[4]。與甜味受體模型非常相似,苦味物質分子與受體之間的結合也可以用AH/B結構來表示,苦味助味基取決于其疏水性結構。許多化學結構迥異的化合物都具有苦味,如生物堿、糖苷、萜類、苦味肽以及金屬離子等,苦味的產生除了與苦味分子的形狀、大小有關,也與所含官能團的性質及其在分子中的位置相關。因此,研究者們把與藥物濃度無關,而僅與藥物分子的屬性相關的苦度,稱之為分子苦度(molecule bitterness,MB)。本研究旨在建立基于苦味閾值濃度(bitterness threshold concentration,BTC)的MB的測量方法,為藥物的苦度評價提供量化指標,并為藥物掩味研究奠定基礎,開拓藥物的商業(yè)價值,提高藥物的服用效果。
BCA2248-CW電子天平、CP225D十萬分之一電子天平,德國Sartorius公司;HK250科導臺式超聲清洗器,上海科導超聲儀器有限公司;AM-5250B磁力攪拌器,天津奧特賽恩斯儀器有限公司;HH-S4A電熱恒溫水浴鍋,北京科偉永興儀器有限公司;TS-5000Z型電子舌,日本Insent公司。
苦味單體:鹽酸小檗堿購自于四川省玉鑫藥業(yè)有限公司,批號為140406,質量分數(shù)為98.62%;奎寧購自于北京莊盟國際生物基因科技有限公司,批號為C10017584,質量分數(shù)為>98.5%;苦參堿、延胡索乙素、穿心蓮內酯、梔子苷、葛根素、柚皮苷、-精氨酸、熊果苷、益母草堿等均購自于西安嘉天生物科技有限公司,批號分別為JT20140418、JT20141010、JT20141026、JT20150214、JT20141102、JT20150222、20140412、JT20150401、JT20150326,質量分數(shù)分別為98.12%、98.12%、98.28%、98.12%、98.54%、98.08%、98.0%、99.59%、98.05%;檸檬苦素、獐牙菜苦苷、蘆薈苷、龍膽苦苷、鹽酸青藤堿、氧化苦參堿、京尼平苷、槐定堿均購自于西安昊軒生物科技有限公司,批號分別為HXNMKS- 150210、HXZYCKG-150326、HXLHG-140815、LDKG20150411、YSQTJ20150315、YHKSJ20150409、JNPG20150415、HDJ20150415,質量分數(shù)分別為98.26%、98.12%、98.12%、98.10%、98.20%、98.50%、98.60%、98.20%。
2.1.1 志愿者篩選 經河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查批準后,課題組對招募的志愿者進行了包括苦味敏感度等在內的嚴格篩選,最終選擇22名健康志愿者(男7名、女15名)作為受試者,在試驗前簽訂知情同意書。
2.1.2 評價方法 將樣品按照濃度由低到高的順序進行編號并置于口嘗紙杯中,并在樣品序列中隨機加入1個陰性樣品(純化水),然后志愿者按編號順序將樣品含于口中,計時15 s,此間口腔做漱口動作,使舌根和舌側的苦味感受區(qū)能夠充分感受藥物是否具有苦味,將結果填入“藥物苦味評價表”中,然后吐出樣品,漱口5次,至口腔內無苦味,1~2 min后測定下1個樣品。
2.1.3 基于BTC的MB 采用最小極限法測定37 ℃下標準苦味物質和其他各苦味單體水溶液的BTC,即半數(shù)志愿者嘗到苦味的最低濃度。以鹽酸小檗堿為標準苦味物質,在鹽酸小檗堿的BTC下,其MB定為1,則其他苦味分子的MB=r/。其中r表示標準苦味物質的BTC;表示未知苦味分子的BTC。通常情況下,不同苦味分子的BTC相差較大,因此導致不同物質的MB數(shù)值上差別很大。為此,引入“分子苦度指數(shù)”(MB-index,MBI),即將MB取自然對數(shù),以減少數(shù)量級差別。
2.1.4 樣品配制 將鹽酸小檗堿配制成濃度分別為3.83、7.65、11.50、15.30、23.00、30.60、61.20 μmol/L的溶液;將苦參堿配制成濃度分別為0.10、0.20、0.31、0.41、0.61、0.81、1.63 mmol/L的溶液;將穿心蓮內酯配制成濃度分別為1.15、1.38、1.73、2.07、2.60、3.11、3.89 mmol/L的溶液;將延胡索乙素配制成濃度分別為1.39、1.85、2.78、3.70、5.55、7.40、11.10 mmol/L的溶液;將獐牙菜苦苷配制成濃度分別為0.05、0.08、0.10、0.15、0.20、0.31、0.41 mmol/L的溶液;將檸檬苦素配制成濃度分別為3.60、5.40、7.20、10.80、14.40、21.60、28.80 μmol/L的溶液;將葛根素配制成濃度分別為0.41、0.62、0.83、1.24、1.65、2.48、3.30 mmol/L的溶液;將奎寧配制成濃度分別為9.23、12.30、18.50、24.60、36.90、49.20、73.80 μmol/L的溶液;將蘆薈苷配制成濃度分別為15.40、23.10、30.80、46.20、61.60、92.30、123.00 μmol/L的溶液;將柚皮苷配制成濃度分別為0.16、0.23、0.31、0.47、0.63、0.94、1.25 mmol/L的溶液;將鹽酸青藤堿配制成濃度分別為20.21、26.93、40.42、53.85、80.84、107.70、161.80 μmol/L的溶液;將梔子苷配制成濃度分別為0.13、0.19、0.25、0.38、0.51、0.76、1.01 mmol/L的溶液;將京尼平苷配制成濃度分別為0.47、0.71、0.94、1.42、1.89、2.83、3.78 mmol/L的溶液;將熊果苷配制成濃度分別為0.73、1.10、1.47、2.20、2.94、4.41、5.97 mmol/L的溶液;將氧化苦參堿配制成濃度分別為3.64、4.87、7.28、9.74、14.56、19.48、29.13 μmol/L的溶液;將益母草堿配制成濃度分別為0.12、0.18、0.24、0.36、0.48、0.71、0.95 mmol/L的溶液;將-精氨酸配制成濃度分別為19.80、26.48、39.60、52.95、79.20、105.90、158.00 mmol/L的溶液;將槐定堿配制成濃度分別為6.87、9.04、13.73、18.09、27.47、36.18、54.94 μmol/L的溶液;將龍膽苦苷配制成濃度分別為14.49、20.71、29.58、42.26、60.37、86.24、123.20 μmol/L的溶液。
2.1.5 離群值的剔除 由于實驗對象為生物樣本,且不同受試者之間存在個體差異,實驗測試數(shù)據(jù)可能有個別異常值。因此,根據(jù)國家標準GBT12315- 2008中8.2.1個人表現(xiàn)判定Spearman相關系數(shù)的規(guī)定,對所有評價員的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,當對陰性樣品的評價仍為“1”,或者違反韋伯-費希納定律:刺激量與刺激強度成正比的規(guī)律,則剔除該評價員對該組樣品的評價結果。
2.1.6 口嘗測試結果 對上述19種苦味單體的口嘗評價結果進行統(tǒng)計分析,結果表明,19種苦味單體濃度的對數(shù)與感知到到苦味的人數(shù)比例成正相關關系,與韋伯-費希納定律一致[7-8]。因此,分別對19種苦味單體感知到苦味的人數(shù)比例為0~100%的范圍內對不同濃度()下感知苦味的人數(shù)比例(0)分別做威布爾曲線和對數(shù)曲線,二者關系式如下。采用“規(guī)劃求解”建立威布爾曲線和Excel建立對數(shù)曲線,19種苦味單體不同的濃度()與感知到苦味的人數(shù)比例(0,在0~100%)之間的擬合方程見表1。其中0代表感知到苦味的人數(shù)比例,代表濃度,e是自然數(shù)對數(shù)的底數(shù),是樣品濃度個數(shù)。
0=1()=[1-e?(C-)/k] (1)
0=1()=ln+(2)
表示濃度,、、、、、為待定參數(shù)
由上述擬合方程的2可知,19種苦味物質的威布爾模型均優(yōu)于對數(shù)曲線模型,因此,采用威布爾模型建立19種苦味物質不同濃度下感知到苦味的人數(shù)比例0模型。以鹽酸小檗堿為標準苦味物質,按照“2.1.3”項所述方法分別計算19種苦味單體的BTC、MB以及MBI,結果見表2。
2.2.1 TS-5000Z電子舌簡介 TS-5000Z電子舌,是采用了類似于人類舌頭味覺細胞工作原理的人工脂膜傳感器技術,可以客觀數(shù)字化的評價食品或藥品等樣品的酸味、甜味、苦味、咸味、鮮味、澀味的先味,同時還可以分析苦味、澀味、鮮味的回味。這個傳感器技術的響應狀態(tài)同人的舌頭對味道的響應極為相似,味覺傳感器上的脂膜通過與呈味物質之間的靜電作用或者疏水性相互作用產生膜電勢的變化,并將該電勢作為傳感器的輸出信號傳輸?shù)诫娔X進行分析,以此認知味強度及味特征。
2.2.2 樣品制備
(1)正極清洗液配制:準確稱量7.46 g氯化鉀,用500 mL蒸餾水攪拌溶解,然后準確加入300 mL無水乙醇溶液,邊攪拌邊加入準確稱量的0.56 g氫氧化鉀,溶解完畢后,轉移到1000 mL量瓶中,定容,即得。
(2)負極清洗液配制:準確量取300 mL無水乙醇,與500 mL蒸餾水震蕩混合,然后加入8.3 mL的濃鹽酸攪拌混合轉移到1000 mL量瓶中,定容,即得。
表1 19種苦味單體不同的濃度C與感知到苦味的人數(shù)比例P0的擬合方程
Table 1 Fitting equation between different concentration (C) of 19 bitter monomers and the proportion (P0) of people who felt bitter
苦味物質n威布爾曲線對數(shù)曲線 鹽酸小檗堿5P0=1.03 [1-e?(C+5.32)3.12/7 723.71],R2=0.968 3,P<0.01P0=0.52 lnC-0.63,R2=0.938 7,P<0.01 苦參堿5P0=1.01 [1-e?(C-0.10)1.33/0.10],R2=0.996 0,P<0.01P0=0.58 lnC+1.34,R2=0.979 8,P<0.01 穿心蓮內酯6P0=1.02 [1-e?(C-1.38)0.87/0.62],R2=0.997 0,P<0.01P0=0.91 lnC-0.10,R2=0.862 2,P<0.01 延胡索乙素6P0=0.95 [1-e?(C-1.85)2.08/2.76],R2=0.994 5,P<0.01P0=0.59 lnC-0.26,R2=0.879 7,P<0.01 獐牙菜苦苷5P0=1.08 [1-e?(C-0.08)1.74/0.03],R2=0.999 8,P<0.01P0=0.75 lnC+1.84,R2=0.968 5,P<0.01 檸檬苦素5P0=1.00 [1-e?(C-3.08)3.99/7 723.71],R2=0.999 3,P<0.01P0=0.81 lnC-1.45,R2=0.927 7,P<0.01 葛根素5P0=0.98 [1-e?(C-0.41)2.19/0.05],R2=0.998 5,P<0.01P0=0.73 lnC+0.78,R2=0.853 6,P<0.05 奎寧6P0=1.02 [1-e?(C-9.23)0.62/2.86],R2=0.992 2,P<0.01P0=0.53 lnC-0.94,R2=0.812 7,P<0.05 蘆薈苷6P0=0.99 [1-e?(C+3.17)3.20/131 481.94],R2=0.992 3,P<0.01P0=0.57 lnC-1.47,R2=0.919 1,P<0.01 柚皮苷4P0=39.50 [1-e?(C-0.07)0.55/23.58],R2=0.994 5,P<0.01P0=0.52 lnC+1.37,R2=0.989 8,P<0.01 鹽酸青藤堿5P0=1.00 [1-e?(C-15.22)2.33/7 723.72],R2=0.997 3,P<0.01P0=0.77 lnC-2.55,R2=0.986 2,P<0.01 梔子苷6P0=0.65 [1-e?(C+1.09)11.34/121.86],R2=0.989 7,P<0.01P0=0.39 lnC+0.72,R2=0.968 5,P<0.01 京尼平苷4P0=0.93 [1-e?(C-0.47)4.13/0.05],R2=0.982 8,P<0.01P0=0.95 lnC+0.48,R2=0.934 1,P<0.05 熊果苷5P0=1.02 [1-e?(C-0.46)1.47/1.20],R2=0.967 2,P<0.01P0=0.64 lnC+0.32,R2=0.960 8,P<0.01 氧化苦參堿7P0=0.96 [1-e?(C+8.93)4.12/139 736.52],R2=0.964 0,P<0.01P0=0.44 lnC-0.37,R2=0.955 1,P<0.01 益母草堿4P0=1.00 [1-e?(C-0.05)1.63/0.08],R2=1.000 0,P<0.01P0=0.43 lnC+1.13,R2=0.922 1,P<0.05 L-精氨酸6P0=0.91 [1-e?(C+68.98)9.70/1.0×1020],R2=0.990 8,P<0.01P0=0.58 lnC-1.69,R2=0.945 5,P<0.01 槐定堿7P0=0.98 [1-e?(C-6.87)1.64/59.73],R2=0.999 3,P<0.01P0=0.55 lnC-1.08,R2=0.950 1,P<0.01 龍膽苦苷5P0=1.02 [1-e?(C-14.49)1.71/187.41],R2=0.999 2,P<0.01P0=0.76 lnC-2.09,R2=0.974 5,P<0.01
表2 19種苦味單體的BTC、MB、MBI
Table 2 BTC, MB and MBI of 19 bitter monomers
名稱BTC/(μmol?L?1)MBMBI 氧化苦參堿7.551.347 30.298 1 鹽酸小檗堿10.171.000 00.000 0 檸檬苦素11.680.870 4?0.138 8 奎寧12.110.839 8?0.174 6 槐定堿16.730.607 7?0.498 0 龍膽苦苷31.370.324 1?1.126 6 蘆薈苷32.550.312 4?1.163 5 鹽酸青藤堿55.170.184 3?1.691 0 獐牙菜苦苷177.630.057 2?2.860 4 柚皮苷184.480.055 1?2.898 2 益母草堿221.680.045 9?3.081 9 苦參堿236.070.043 1?3.144 8 梔子苷484.180.021 0?3.863 1 葛根素641.480.015 9?4.144 5 京尼平苷929.700.010 9?4.515 6 熊果苷1 325.890.007 7?4.870 5 穿心蓮內酯1 744.090.005 8?5.144 7 延胡索乙素3 263.420.003 1?5.771 2 L-精氨酸43 748.660.000 2?8.366 9
(3)參比液配制:準確稱量2.24 g氯化鉀和0.045 g酒石酸用500 mL水溶解,然后轉移到1000 mL量瓶中,定容,即得。
(4)待測樣品溶液配制:鹽酸小檗堿、苦參堿、穿心蓮內酯、葛根素、氧化苦參堿溶液配制方法同“2.1.4”項下各樣品溶液的配制方法。
2.2.3 電子舌測試方法 TS-5000Z型電子舌測量程序:首先在清洗液中清洗90 s,接著用參比液清洗120 s、繼續(xù)用新的參比液清洗120 s,傳感器在平衡位置歸零30 s,達到平衡條件后,開始測試,測試時間30 s;在2組參比液中分別短暫清洗3 s,傳感器插入新的參比液中測試回味30 s。循環(huán)測試4次,去掉第1次循環(huán),取后3次平均數(shù)據(jù)作為測試結果。每次清洗、平衡和測試回味的液體均分布在不同樣品杯中。
2.2.4 指標選擇 TS-5000Z味覺分析系統(tǒng)中常用的指標有先味(relative value,)及回味(change of membrane potential caused by adsorption,CPA)[5-6],二者分別表示如下。
=s-r(3)
CPA=r′-r(4)
r為傳感器在參比液中的電勢值,s為傳感器在待測樣品中的電勢值,r′為傳感器在參比液中短暫清洗后的電勢值
2.2.5 傳感器的選擇 TS-5000Z電子舌共有C00、AN0、BT0、AE1、GL1、CA0、CT0 7根傳感器,其中C00和AE1傳感器有先味和回味2種味覺信息,而AN0和BT0傳感器只輸出回味值。因此本實驗選取跟苦味有關的4根傳感器,分別為C00、AN0、BT0、AE1傳感器,共輸出6種味覺信息值,具體見表3。
表3 傳感器味覺信息
Table 3 Sensors taste information
傳感器名稱對應的味覺味覺信息 先味回味 C00酸性苦味苦味(bitterness)酸性苦味(aftertaste-B) AN0堿性苦味?堿性苦味(B-bitterness2) BT0堿基鹽類苦味?堿基鹽類苦味(H-bitterness) AE1澀味澀味(astringency)澀味(aftertaste-A)
?表示沒有先味指標
? indicates that there is no taste indicator
2.2.6 電子舌測試結果
(1)不同樣品的味覺特征雷達圖:圖1顯示了不同樣品的味覺雷達圖,其中橫坐標和縱坐標的單位表示味覺的單位,1個單位代表樣品之間濃度相差了20%,經專業(yè)人員鑒定20%的濃度差異是正常的人能夠感覺到的,如果相差低于1個單位,那么正常的人就不能感覺到樣品之間的差異[9]。5種樣品的味覺信息如圖1所示。結果表明,BT0傳感器和AN0傳感器對鹽酸小檗堿響應顯著,且隨著樣品濃度的增大,苦味回味也呈增大趨勢;苦參堿此濃度范圍下C00傳感器和AE1傳感器對苦參堿響應顯著,且隨著樣品濃度的增大,苦味和澀味均呈增大趨勢,苦味和澀味的回味很??;葛根素在測量濃度范圍內AN0傳感器和C00傳感器響應顯著,但是AN0傳感器的響應值隨著濃度的增加先增大后減小,C00傳感器響應無規(guī)律;對于氧化苦參堿和穿心蓮內酯,所有傳感器的響應值均較小,不在最佳輸出范圍內。
(2)苦味物質BTC的確定:以鹽酸小檗堿為標準苦味物質,基于口嘗法,測得BTC,然后測得BTC時的電子舌傳感器響應值,對于未知物質,仍然采用電子舌測得其不同濃度的傳感器響應值,在與標準苦味物質傳感器響應值相同時,未知物質的濃度即為其BTC。
圖1 樣品的味覺信息雷達圖
對不同濃度的鹽酸小檗堿的電子舌AN0和BT0傳感器的測定結果進行統(tǒng)計分析,結果表明,鹽酸小檗堿濃度的對數(shù)與AN0傳感器和BT0傳感器的響應值(e)呈正相關關系,如圖2所示。由表2可知,鹽酸小檗堿的BTC為10.17 μmol/L,在該濃度下,BT0傳感器的響應值為8.68,AN0傳感器的響應值為3.80。對于苦參堿,其AN0傳感器和BT0傳感器均無響應,僅C00傳感器有響應,但是TS-5000Z電子舌各傳感器測得的味覺信息之間相互獨立,不能相互轉換,因此,以鹽酸小檗堿作為標準苦味物質,未能計算出苦參堿的BTC。
圖2 不同濃度的鹽酸小檗堿傳感器響應圖
在進行藥物苦味評價時,一般選擇奎寧作為標準苦味物質,但因其相對不易得、有一定毒性等原因,在中藥苦度評價時,選擇鹽酸小檗堿比奎寧更具有可比性和代表性[10]。因此,本實驗選擇鹽酸小檗堿作為標準苦味物質。
常見的中藥中具有苦味的化學成分有生物堿、苷類、萜類、苦味肽等[11-13],對上述19種苦味物質進行分類,其中,鹽酸小檗堿、苦參堿、延胡索乙素、奎寧、氧化苦參堿、鹽酸青藤堿、益母草堿、槐定堿屬于生物堿類化合物;獐牙菜苦苷、葛根素、蘆薈苷、柚皮苷、梔子苷、京尼平苷、熊果苷屬于苷類化合物;穿心蓮內酯、檸檬苦素、龍膽苦苷屬于萜類化合物;-精氨酸屬于苦味肽類化合物。該部分內容的研究均基于口嘗法,選擇的苦味單體載體必須對人體無毒害作用,且水溶性要好,由于這些因素的限制,每一類化學成分中選擇的載體數(shù)量不一。
BTC為半數(shù)志愿者能夠感知到苦味的最低濃度,由于評價員味覺靈敏度、個體差異等因素,測得的BTC會存在一定的差異,因此,實驗前應對評價員進行規(guī)范化培訓,此外,先進的味覺傳感器的使用可以彌補口嘗法主觀性強的缺陷。其次,樣品來源不同,純度高低不同也會影響預測結果,因為本研究中涉及的苦味單體均為中藥飲片經提取分離得到,中藥飲片化學成分繁多,最終得到的樣品中仍會殘留有部分雜質,由于味覺神經復雜的傳遞機制,殘留的雜質可能會對苦味的呈現(xiàn)起到協(xié)同或拮抗作用,本研究中使用的單體質量分數(shù)均>98%,使用質量分數(shù)更高的單體能夠獲得更加準確的BTC。
文獻中記載的部分單體的BTC與實驗測得的BTC如表4所示。文獻記載的BTC和本實驗測得的BTC進行配對檢驗,結果表明2組數(shù)據(jù)間不存在顯著性差異(>0.05),驗證了本研究結果的準確性及實驗方法的可行性。
本研究定義的MB是基于BTC的,進行基于電子舌的BTC預測時,樣品溶液濃度的設定與口嘗法相同,但實驗結果表明,對于氧化苦參堿[17],在較高的濃度時C00傳感器對其有響應,且隨著測試溶液濃度的增高,其響應值也隨著增加,但是在對于口嘗法測得的BTC時,其傳感器無響應。實驗結果表明,對于某些化合物,在較低濃度時,TS-5000Z電子舌傳感器不能與化合物相互作用,進而不能實現(xiàn)對化合物的味覺辨識。因此,靈敏度更高的傳感器膜的開發(fā),對于實現(xiàn)電子舌在藥物BTC預測方面具有重要意義。
表4 文獻中記載的單體BTC與實驗測得的BTC的差異
Table 4 BTC difference of monomers between recorded in literature and measured experimentally
單體名稱BTC/(μmol?L?1) 文獻記載實測 奎寧10.00[14]12.11 鹽酸小檗堿6.62[10]10.17 柚皮苷34.45[15-16]184.48 檸檬苦素2.13[15]11.68
本研究以生物堿類化合物鹽酸小檗堿作為標準苦味物質,對于TS-5000Z電子舌,其AN0和BT0兩根苦味傳感器能對其產生特異性響應,而苦味傳感器C00則不響應,這3根傳感器的響應值之間相互獨立,彼此之間不能轉化,因此,若某種苦味物質采用TS-5000Z傳感器測定時,對AN0和BT0傳感器能夠產生響應,則可以采用本研究的方法預測其BTC,而本研究選擇的載體,沒有對AN0傳感器和BT0傳感器產生響應的物質,在后續(xù)的研究中,應擴大研究載體,篩選能夠對AN0傳感器和BT0傳感器產生響應的物質,對此方法的可行性進行驗證。同時,可嘗試選擇不同味覺辨識機制的味覺傳感器,建立對所有苦味物質均適用的預測BTC的方法。
苦味分子可略分2類[18-19]:一類含僅具有限水溶性的疏水親脂性物質,諸如萜類等;另一類含強極性化合物,這類物質若不僅能有效地干擾苦味受體的靜電相互作用,也仍能形成強的疏水相互作用,如奎寧、咖啡因等生物堿[20]。有研究表明,一些結構類似的化合物具有類似的苦味性質,然而其空間同分異構體構型不同往往又表現(xiàn)出不同的性質。如,-色氨酸是典型的苦味化合物,然而其D型的對應異構體卻表現(xiàn)出了甜味的性質;槲皮素只有輕微的澀味,但是其相同濃度的同分異構體卻具有很強的苦味;橘皮苷沒有苦味,然而其位置異構體卻具有很強的苦味[21]。此外化合物的苦味有時還與其所處的環(huán)境存在著密切關系,如亞麻油酸在溶液中只有很弱的苦味,而在乳劑中卻表現(xiàn)出很強的苦味[22-23]。
苦味化合物在自然界中分布廣泛,縱觀國內外的研究,苦味與化合物的結構有一定的關系,但是目前仍不能闡明苦味由何而來。研究者們曾認為化合物中疏水基團決定了分子的苦味,但是如之前所述,同分異構體能表現(xiàn)出截然不同的苦味性質,這表明空間結構也對苦味性質極為重要。近年來,很多關于預測化合物苦味的模型被建立起來,如Rodgers等[24]利用已知的近2萬種苦味化合物和非苦味化合物建立的模型,在已知的化合物中,對苦味化合物的辨別能力達到72%,但是該模型篩選出來的化合物只有極少數(shù)(33個)被驗證具有苦味。按照現(xiàn)在的研究成果,對從未嘗過的化合物判斷其苦味性質還是非常困難的,這也和苦味化合物與受體的結合機理有關,仍需要進一步的探討。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突
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Study on quantitative method of drug’smolecular bitterness based on bitterness threshold concentration
GAO Xiao-jie1, BAI Ming-xue1, GUI Xin-jing2, 3, 4, 5, 6, WANG Yan-li2, 3, 4, 5, 6, WANG Jun-ming3, YAO Jing2, 3, 4, 5, 6,ZHANG Lu2, 3, 4, 5, 6, SHI Jun-han2, 3, 4, 5, 6, LI Xue-lin2, 3, 4, 5, 6, LIU Rui-xin2, 3, 4, 5, 6
1. Department of Pharmaceutical Preparation, Traditional Chinese Medicine Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450007, China 2. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 3. Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China 4. Henan ModernizationEngineering Research Center for Clinical Application of Traditional Chinese Medicine Decoction Pieces, Zhengzhou 450000, China 5. Provincial Co-construction Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Respiratory Diseases with Traditional Chinese Medicine, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 6. Henan Key Laboratory for Clinical Pharmacy of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China
To establish a quantitative method of drugs’ molecular bitterness (MB) which is only related to the properties of the drug molecule itself.In this paper, berberine hydrochloride was used as standard bitter substance and berberine hydrochloride, quinine, matrine, tetrahydropalmatine, andrographolide, gardenoside, puerarin, naringin,arginine, arbutin, leonurine, limonin, swertiamarin, aloin, gentiopicroside, sinomenine hydrochloride, oxymatrine, geniposide, sophoridine with different concentrations solutions were used as research carriers, based on the minimum limit method, the bitterness threshold concentration (BTC) of bitter monomer was predicted by traditional human taste panel method, and calculated the MB using BTC finally; Using berberine hydrochloride, matrine, oxymatrine, andrographolide, puerarin solutions with different concentrations as the carriers, the response value of different concentration solutions were measured by electronic tongue. Then, the BTC of the bitter molecules were predicted, and finally the MB of the bitter monomers was predicted.It was measured that the relationship between the proportion of people who felt bitter and the concentration of bitterness monomer conforms to the Weibull curve by using traditional human taste panel method, then the BTC was calculated from the fitted curve, and finally the MB of 19 kinds of bitter monomers were measured; Within the measurement range of the BTC test, the electronic tongue sensors only got valid data for the measurement of berberine hydrochloride and matrine, but the sensor that responded to them were different, and the information between the different sensors were independent, so the BTC of matrine could not be obtained by using electronic tongue.A method for the determination of MB based on BTC was established by using traditional human taste panel method, and the MB of 19 bitter monomers were determined; Although we failed to establish the MB determination method by using electronic tongue, it can be used as a reference for the further study of quantitative methods of bitterness.
minimum limit method; bitterness threshold; molecular bitterness; traditional human taste panel method; electronic tongue; berberine hydrochloride; matrine
R283.6
A
0253 - 2670(2022)03 - 0696 - 08
10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.007
2021-08-27
國家自然科學基金面上項目(81774452);國家自然科學基金青年基金項目(81001646);2017年國家重點研發(fā)計劃中醫(yī)藥現(xiàn)代化重點專項(2017YFC1703402);河南省中醫(yī)藥拔尖人才培養(yǎng)項目資助(2019ZYBJ07);河南省高層次人才特殊支持“中原千人計 劃”-“中原青年拔尖人才”項目(ZYQR201912158);河南省衛(wèi)生健康中青年學科帶頭人專項(HNSWJW-2020014)
高曉潔,碩士,主管中藥師,從事中藥制劑的開發(fā)以及質量控制研究。Tel: (0371)86223662 E-mail: 498577500@qq.com
劉瑞新,博士,主任藥師,從事中藥飲片臨床應用現(xiàn)代化關鍵技術研究。Tel: (0371)66233562 E-mail: liuruixin7@163.com
[責任編輯 鄭禮勝]