李文永，伍宏亮，鄧 碩，黃俊峰，代昌遠(yuǎn)，關(guān) 翰，李慶文，薛 勝

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽 蚌埠 233004)

前列腺癌是男性最常見的癌癥診斷之一。前列腺癌是美國男性的第二大死因[1]，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，在我國由于老齡化的進展，發(fā)病率也逐年上升，嚴(yán)重威脅男性的健康，前列腺癌常發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[2]。盡管手術(shù)治療、化療及內(nèi)分泌治療取得了一定的成果，但仍然無法阻止前列腺癌的進展。因此，迫切需要我們對其分子機制更深入的研究，而前列腺癌異常的能量代謝機制是當(dāng)前研究的熱點，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤基因調(diào)控代謝平衡從而影響癌細(xì)胞的增殖能力[3]。微小 RNA(miRNA)是非編碼RNA，可作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。miRNA在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面已顯示出其生物學(xué)功能[4]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-612(miR-612)與多種腫瘤的生長有關(guān)，包括結(jié)腸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤和卵巢癌[5]。然而，其在前列腺癌中的作用機制仍知之甚少，通過Targetscan分析顯示叉頭框蛋白P1(FOXP1)可能是miR-612靶基因。FOXP1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[6]。但miR-612能否調(diào)控FOXP1表達(dá)而影響前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力尚未可知。因此，本研旨在探索前列腺癌細(xì)胞中miR-612與FOXP1可能對增殖、遷移及侵襲能力的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料人前列腺癌細(xì)胞系DU145、PC3、LNCaPC-81和人前列腺上皮細(xì)胞RWPE1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清、雙抗、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶來源于美國Hyclone公司；Transwell小室購于美國康寧公司；MTT試劑盒購于美國MCE公司；實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于廣州洛唯爾生物科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購于美國Abcam公司；ECL Western Blotting試劑盒購于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購于杭州馨然生物科技有限公司；兔抗FOXP1抗體購于美國Abcam公司；FOXP1過表達(dá)質(zhì)粒、miR-612 mimic、miR-612 inhibitor及其對照miR-NC購于蘇州賽業(yè)生物科技有限公司；Lipofectamine 2000購于美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 組織標(biāo)本的收集選擇2020年6月至2021年6月在我院住院期間確診為前列腺腺泡腺癌患者18例，前列腺癌組織(n=18)和癌旁組織(n=18)經(jīng)手術(shù)切除后立即在液氮中速凍組織，使用前在-80 ℃下儲存。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實為前列腺癌。我們的研究得到了本院倫理委員會的批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)使用含有100 μg/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素雙抗、10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PC3細(xì)胞，RWPE1細(xì)胞采用無血清培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，隔兩天換液一次，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代.

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染選取上述三種人前列腺癌細(xì)胞系中miR-612相對表達(dá)最低的PC3細(xì)胞作為實驗細(xì)胞，收集PC3細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液(5×104個/mL)，100 μL/孔的密度接種于6孔板，用無血清DMEM稀釋FOXP1過表達(dá)質(zhì)粒、miR-612 NC、miR-612 mimic、miR-612 inhibitor或Lipofectamine 2000。將轉(zhuǎn)染混合物加入細(xì)胞懸液中并孵育6 h后用含有10% FBS的DMEM代替轉(zhuǎn)染混合物。在進行測定之前將細(xì)胞培養(yǎng)48 h。

1.5 RT-qPCR使用Trizol提取細(xì)胞的總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。對于mRNA和miRNA檢測，分別在ABI 7500熱循環(huán)儀(Life Technologies)上使用RT-qPCR試劑盒進行實時PCR。GAPDH或U6基因用作內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min，95 ℃15 s和60 ℃30 s，40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法分析相對表達(dá)。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測用miRWalk(mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)預(yù)測miR-612的靶基因，通過雙熒光素酶報告試驗進一步驗證預(yù)測結(jié)果。將PC3細(xì)胞分成6組，分別轉(zhuǎn)染miR-612 mimic+野生型WT-FOXP1、miR-NC+野生型WT-FOXP1、miR-612 mimic+突變型MUT-FOXP1、miR-NC+突變型MUT-FOXP1、對照組(野生型WT-FOXP1或突變型MUT-FOXP1)，轉(zhuǎn)染后每組以1×104個/孔細(xì)胞接種于96孔板，孵育48 h后，100 μL/孔加入細(xì)胞裂解液，取上清液加入40 μL螢火蟲熒光素底物，充分混合后測定熒光強度，取剩余上清液加入40 μL海腎熒光素酶底物，充分混合后測定熒光強度，使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)(Promega)來確定海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的活性。

1.7 細(xì)胞增殖試驗采用MTT法檢測細(xì)胞增殖。將不同組的PC3細(xì)胞1×104個/孔接種到96孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)12 h、24 h、48 h或72 h。然后，加入20 μL MTT(5 mg/mL)。通過使用酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo Fisher Scientific)測定570 nm處的光密度(OD)來檢測甲臜的產(chǎn)生。

1.8 細(xì)胞侵襲試驗使用預(yù)涂有Matrigel的Transwell室進行細(xì)胞侵襲測定。將300 μL 5×105個細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液加入上室，下室加入500 μL 10%FBS DMEM。未通過毛孔遷移或侵入的細(xì)胞被清除。將濾膜固定在90%酒精中并用0.1%結(jié)晶紫染色，并在倒置顯微鏡(Olympus，日本 )下觀察。添加0.5 g/L MTT，并使用Bio-TekTMELX-800TM吸光度酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國 )測量570 nm處的光密度。測定相對細(xì)胞侵襲能力。

1.9 蛋白印跡實驗使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。用10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，然后在5%脫脂奶粉中封閉。 PVDF膜與兔抗FOXP1單克隆抗體(1∶100)或小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶100)一起孵育，作為內(nèi)部參考。之后，將PVDF膜與小鼠抗兔二抗(1∶20 000)一起孵育。使用ECL Western Blotting試劑盒檢測免疫復(fù)合物。Image-Pro plus軟件6.0用于分析相對蛋白質(zhì)表達(dá)，表示為與GAPDH的密度比。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，連續(xù)數(shù)據(jù)表示為“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。t檢驗或單因素方差分析用于分析組間的差異。使用GraphPad Prism 6.0軟件進行圖形制作。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-612在PC3細(xì)胞中表達(dá)降低通過RT-qPCR檢測miR-612表達(dá)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，前列腺癌組織中miR-612的表達(dá)顯著降低(P<0.05，圖1A)；miR-612的表達(dá)水平在人前列腺癌細(xì)胞系(DU145、PC3、LNCaPC-81)中明顯降低，分別與正常人前列腺上皮細(xì)胞(RWPE1)相比均有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，圖1B)。

圖1 miR-612在前列腺癌細(xì)胞及組織中的相對表達(dá)

2.2 miR-612的過表達(dá)抑制PC3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-612 mimic、miR-612 inhibitor后PC3細(xì)胞中miR-612的表達(dá)水平明顯升高或降低(P<0.05，圖2A)；MTT試驗顯示miR-612過表達(dá)顯著抑制PC3細(xì)胞增殖，而miR-612敲減增強PC3細(xì)胞的增殖能力(P<0.05，圖2B)；劃痕試驗結(jié)果顯示miR-612過表達(dá)顯著抑制PC3細(xì)胞遷移，而miR-612敲減增強PC3細(xì)胞的遷移能力(P<0.05，圖2C)；Transwell試驗數(shù)據(jù)進一步表明miR-612過表達(dá)顯著抑制PC3細(xì)胞侵襲，而miR-612敲減增強PC3細(xì)胞侵襲(P<0.05，圖2D)。

圖2 miR-612過表達(dá)抑制PC3細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力

2.3 miR-612可能靶向抑制FOXP1基因的表達(dá)使用生物信息學(xué)預(yù)測和Targetscan(http://www.targetscan.org/)進一步分析了miR-612的靶標(biāo)(圖3A、3B)。熒光素酶報告基因測定顯示熒光素酶活性僅在與miR-612 mimic和野生型FOXP1 3'UTR共轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞中顯著下調(diào)(P<0.05，圖3C)。然而，其他組的熒光素酶活性沒有變化。通過蛋白質(zhì)印跡進一步檢測了miR-612對PC3細(xì)胞中FOXP1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，結(jié)果顯示與對照組相比，過表達(dá)miR-612的PC3細(xì)胞中FOXP1蛋白表達(dá)水平顯著降低，但在miR-612敲減后升高(P<0.05,圖3D)。

圖3 miR-612靶向抑制FOXP1基因表達(dá)

2.4 FOXP1參與miR-612介導(dǎo)的PC3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲結(jié)果顯示miR-612 mimic+FOXP1組的FOXP1表達(dá)水平顯著高于miR-612 mimic組(P<0.05，圖4A)；MTT試驗顯示miR-612 mimic+FOXP1組細(xì)胞增殖能力增強(P<0.05，圖4B)；劃痕試驗顯示miR-612 mimic+FOXP1組細(xì)胞遷移能力增強(P<0.05，圖4C)；Transwell試驗顯示miR-612 mimic+FOXP1組促進了細(xì)胞侵襲(P<0.05，圖4D)。

圖4 miR-612調(diào)控FOXP1表達(dá)影響

3 討論

miRNA是單鏈內(nèi)源性非編碼小RNA，長度約22個核苷酸，對調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)具有重要作用[7]。在不同的腫瘤中miRNA的常表達(dá)有異常，對腫瘤的增殖、遷移、細(xì)胞周期與凋亡、侵襲和分化等表型的調(diào)控密切相關(guān)[8]。miR-612已被證明通過調(diào)節(jié)主要的腫瘤相關(guān)生物學(xué)行為在多種癌癥中表現(xiàn)出腫瘤抑制活性[9]，然而，miR-612在前列腺癌中的表達(dá)狀態(tài)及相關(guān)機制仍不清楚，本研究中。我們檢測到前列腺癌樣本中miR-612的表達(dá)顯著降低，并確定了其在前列腺癌中的臨床意義。此外，我們進一步探討了miR-612在前列腺癌中的作用和潛在機制，F(xiàn)OXP1是前列腺癌中的一種癌基因，被進一步鑒定為PC3細(xì)胞中miR-612的直接靶標(biāo)，體外研究表明，miR-612可以抑制PC3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，至少部分是通過直接抑制FOXP1蛋白的表達(dá)有關(guān)，我們還發(fā)現(xiàn)FOXP1 mRNA顯著增加，并且與前列腺癌中的miR-612水平呈負(fù)相關(guān)。

最近研究發(fā)現(xiàn)miR-612水平在胃癌細(xì)胞中顯著降低[10]，在本研究中，RT-PCR數(shù)據(jù)表明，與正常前列腺組織相比，前列腺癌組織中的miR-612顯著下調(diào)，說明miR-612可能在前列腺癌中充當(dāng)腫瘤抑制因子，為進一步使用前列腺癌PC3細(xì)胞系來研究miR-612在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的確切作用，我們用miR-612 mimic轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞以上調(diào)miR-612，并觀察到miR-612過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的顯著抑制，在其他癌癥中也報道了miR-612對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等表型的抑制作用。Yang等人發(fā)現(xiàn)miR-612通過靶向NOB1抑制宮頸癌的進展[11]。Sheng等人報道m(xù)iR-612通過靶向AKT2負(fù)調(diào)控結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[12]。此外，Wang等人發(fā)現(xiàn)miR-612抑制FOXM1表達(dá)從而抑制胃癌中的腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移[13]。上述研究結(jié)果表明miR-612可能成為前列腺癌新的分子干預(yù)靶點。

通過Targetscan預(yù)測miR-612的靶基因，結(jié)果顯示FOXP1可能是miR-612的靶基因，雙熒光素酶報告實驗及蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)miR-612可靶向負(fù)性調(diào)控FOXP1的表達(dá),進一步研究發(fā)現(xiàn)FOXP1過表達(dá)可促進前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。FOXP1是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，具有廣泛的功能。其過度表達(dá)在許多類型的淋巴瘤中預(yù)后不良，這表明FOXP1可能在其他組織類型中充當(dāng)腫瘤抑制基因[14]。有研究報道FOXP1在結(jié)腸癌中表達(dá)異常，參與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程，可能成為結(jié)腸癌診治的新腫瘤標(biāo)記物[15]。FOXP1在胃癌組織中表達(dá)顯著升高，與腫瘤大小、分化程度等病理特征及預(yù)后密切相關(guān)[16]。此外，F(xiàn)OXP1在腫瘤免疫中也發(fā)揮著一定作用，有報道發(fā)現(xiàn)FOXP1負(fù)調(diào)控人乳腺癌中的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞遷移[17]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)FOXP1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-612介導(dǎo)的對PC3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制，進一步驗證了FOXP1在前列腺癌細(xì)胞中充當(dāng)了miR-612的下游效應(yīng)因子發(fā)揮作用，miR-612/FOXP1軸可能成為前列腺癌的潛在治療靶點，未來將在更大樣本的研究中進一步檢驗miR-612在前列腺癌中的診斷和預(yù)后潛力。

綜上所述,我們的研究結(jié)果揭示了miR-612在前列腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用，通過靶向FOXP1部分抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，miR-612/FOXP1軸可能成為前列腺癌的潛在治療靶點。