韓 雪，江 波，郭術俊，華夢晴，尹梅花，宋傳旺，桑道乾

(蚌埠醫(yī)學院 1.檢驗醫(yī)學院免疫學教研室；2.第一附屬醫(yī)院神經內科；3.感染與免疫安徽省重點實驗室；4.慢性疾病免疫學基礎與臨床安徽省重點實驗室；5.檢驗醫(yī)學院，安徽 蚌埠 233030)

吉蘭-巴雷綜合征(GBS)是急性多神經根病變的自身免疫病[1]，以進行性肌無力為特征，最終導致呼吸衰竭[2]。調節(jié)性B細胞(Regulatory B cells，Bregs)是機體調節(jié)炎癥等免疫學反應[3]的重要免疫調節(jié)細胞，人外周血中Bregs具有CD19+CD24hiCD38hi的表型[4]。Bregs是免疫抑制細胞，抑制過度炎癥反應[5]，通過產生IL-10、IL-35和TGF-β1等抑炎性細胞因子發(fā)揮作用[6-7]。

在系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等自身免疫病中，Bregs在數量和功能上均受損[8]。然而，Bregs和血清抑炎性細胞因子在GBS發(fā)病中的作用有待進一步明確。因此，本研究比較了40例新診斷的GBS患者與40例健康對照組的外周血Bregs、記憶性B細胞、漿細胞的數量和血清抑炎性細胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1的水平。

1 材料和方法

1.1 病人和健康對照組本研究在蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院進行GBS患者標本采集，標本采集時間為2019年11月至2021年1月。根據2019年中國GBS診斷標準進行GBS診斷。診斷標準如下:(1)多有前期感染史，起病急，進行性加重，多在4周內達到高峰；(2)嚴重GBS患者的四肢對稱、延髓支配肌肉、面肌無力、呼吸肌無力；(3)可伴有感覺異常和自主神經功能障礙；(4)腦脊液中的蛋白質-細胞分離；(5)電生理檢查提示周圍神經脫髓鞘，如潛伏期延長、F波異常、傳導阻滯、波形彌散異常等。

GBS患者和健康成年志愿者的納入和排除標準如下:(1)為了避免因為免疫系統發(fā)育不成熟影響研究結果，本研究均選取年齡≥18歲的成年人為研究對象；(2)研究對象的性別根據臨床患者性別情況及知情同意情況進行選取，健康對照組性別與GBS患者性別一致；(3)根據GBS起病急，進行性加重，多在4周內達到高峰的診斷標準，所有患者均為新確診，參與研究時均處于GBS急性期；(4)由于藥物治療會影響研究結果，所有參與研究的GBS患者及健康對照組均未接受靜脈注射免疫球蛋白治療。

本研究對40名GBS患者(26名男性和14名女性)進行研究，同時以40名健康成年志愿者(26名男性和14名女性)作為健康對照組。兩組研究對象均按照上述納入和排除標準進行選擇。本研究經蚌埠醫(yī)學院倫理委員會批準，所有GBS患者都簽署了知情同意書。

1.2 標本采集每名GBS患者和健康對照組人員采集5 mL外周靜脈血，肝素抗凝。吸取1 mL外周靜脈血用于流式細胞術實驗(詳見1.3)。剩余4 mL外周靜脈血低速離心(1 847×g)10 min，分離血清用于檢測IL-10、IL-35和TGF-β1含量。

1.3 B細胞亞型的數量檢測全血與熒光抗體在4 ℃孵育30 min。所用熒光抗體分別為異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗CD24抗體、藻紅蛋白(PE)標記的抗CD19抗體、PEcy5標記的抗CD27抗體和APC標記的抗CD38抗體(抗體均來自eBioscience， San Diego， CA， USA)。 然后用3 mL 0.83%氯化銨在22 ℃恒溫水浴中裂解紅細胞10 min，低速(1 847×g)離心5 min。棄上清液，用2 mL PBS 重懸細胞，再次低速(1 847×g)離心5 min，棄上清液后加入400 μLPBS。用流式細胞儀(BD FACSVerse； BD Biosciences， San Jose， CA， USA)檢測CD19+B淋巴細胞，具體檢測CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD27+CD24hi記憶性B細胞和CD19+CD27hiCD38hi漿細胞的數量。

1.4 血清IL-10、IL-35和TGF-β1檢測從GBS患者和健康對照組人員外周靜脈血中分離的血清以500 μL/管進行分裝，使用商品試劑盒(CUSABIO，中國湖北武漢)按照說明書進行IL-10、IL-35和TGF-β1的酶聯免疫吸附檢測，本實驗采用定量酶免疫分析技術。所用商品試劑盒已將IL-10、IL-35和TGF-β1特異性抗體預包被于微孔板上。將標準品和血清樣品移加入各孔中，包被的特異性固相化抗體結合血清標本中的IL-10、IL-35和TGF-β1。洗去所有未結合物質后，向孔中加入抗IL-10、IL-35和TGF-β1的生物素標記抗體。洗滌后，將親和素結合的辣根過氧化物酶(HRP)加入各孔中。洗滌去除任何未結合的親和素酶試劑后，向孔中加入底物溶液，顯色顏色深淺與初始步驟中所結合的IL-10、IL-35和TGF-β1的量成正比。終止顯色后，用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度值。

1.5 統計學分析采用SPSS 16.0軟件對數據進行分析,計量數據以“均數±標準差”表示。組間結果采用t檢驗進行比較，P<0.05為有統計學意義。所有實驗均獨立重復3次。

2 結果

2.1 GBS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細胞的比例降低流式細胞術結果發(fā)現，與健康對照組相比，GBS患者外周血中CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細胞的比例顯著降低(P<0.01，見圖1)。GBS患者和健康對照組相比較，外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細胞和CD19+CD27hiCD38hi漿細胞占外周血總B細胞的比例無顯著差異(見圖2和圖3)。

圖1 GBS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細胞比例

圖2 GBS患者外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細胞占總B細胞比例

圖3 GBS患者外周血CD19+CD27hiCD38hi漿細胞占總B細胞比例

2.2 GBS患者血清中IL-10、IL-35和TGF-β1水平升高與健康對照組相比，GBS患者血清中IL-10、IL-35和TGF-β1水平均升高(圖4)。

圖4 GBS患者血清IL-10、IL-35和TGF-β1的ELISA結果

3 討論

在全球范圍內，GBS是非脊髓灰質炎病毒急性弛緩性麻痹最常見的病因[9]。預先感染病原體通常是GBS的觸發(fā)因素[10]。GBS的發(fā)病機制涉及分子模擬，一些病原體有類似于周圍神經髓鞘和/或軸突表位的抗原?？漳c彎曲桿菌、巨細胞病毒、Epstein-Barr病毒、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、乙型肝炎病毒[11]、戊型肝炎病毒、SARS-CoV和MERS-CoV與GBS的發(fā)生有關。目前，在Zika病毒大流行和COVID-19大流行期間，GBS發(fā)病率有所上升[12]。

Bregs是實現自身免疫的關鍵參與者，是負向調節(jié)免疫的細胞。在自身免疫性疾病中，包括系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、免疫性血小板減少癥和Graves病，CD19+CD24hiCD38hiBregs數量減少[8]。GBS是外周神經自身免疫性疾病，我們研究發(fā)現GBS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細胞的比例降低，這與上述研究[8]一致。

考慮到有研究表明記憶性B細胞和漿細胞在自身免疫性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[13]，我們同時也檢測了外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細胞和CD19+CD27hiCD38hi漿細胞占總B細胞的比例。本研究的創(chuàng)新點在于首次對GBS患者外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細胞數量和CD19+CD27hiCD38hi漿細胞數量進行了分析，為闡明GBS疾病進展及發(fā)病機制提供部分依據。記憶性B細胞迅速分化為效應細胞，因此它們在自身免疫性疾病中的作用不容忽視。研究發(fā)現GBS患者外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細胞數量與健康對照組相比無顯著差異。缺乏差異可以反映GBS患者疾病處于早期階段。如果抗體在疾病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，那么外周血的CD19+CD27hiCD38hi漿細胞的數量將與健康對照組不同。然而，我們發(fā)現在GBS患者和健康對照組中CD19+CD27hiCD38hi漿細胞的比例并沒有顯著差異，這表明抗體的功能可能在GBS發(fā)病機制中不占主導地位。

免疫應答的調節(jié)機制復雜，包括Bregs分泌的抑炎性細胞因子IL-10、IL-35和TGF-β1。因此，檢測GBS患者血清中IL-10、IL-35和TGF-β1的水平對闡明GBS的發(fā)病機制具有重要意義。IL-10的分泌促進Bregs對自身抗原的耐受及其抗炎活性和對自身免疫反應的抑制[4，6]，研究認為IL-35和TGF-β1也是免疫抑制/抗炎性細胞因子[7]。與這些觀點不一致的是，我們發(fā)現與健康對照組相比，新發(fā)GBS患者血清中IL-10、IL-35和TGF-β1的表達卻均升高。

調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Tregs)抑制B細胞的活化、增殖和分化[13]。在系統性紅斑狼瘡中，漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoi dsdendritic cells，pDCs)和Bregs之間存在異常反饋調節(jié)。狼瘡動物模型中，骨髓源性抑制細胞(myeloids-derived suppressorc ells，MDSCs)作為一種免疫抑制細胞，通過誘導型一氧化氮合酶(nitric oxide synase，iNOS)發(fā)揮Bregs效應，從而抑制自身免疫反應。綜上所述，Tregs、pDCs和MDSCs也可能參與了自身免疫性疾病GBS的發(fā)病。在自身免疫性疾病的發(fā)病機制中，T細胞和單核細胞也可能產生和釋放IL-10、IL-35和TGF-β1[14]。據此分析，在自身免疫性疾病患者中，Bregs來源的抑炎性細胞因子可能僅占體內IL-10、IL-35和TGF-β1的一部分。本研究中，GBS患者外周血Bregs減少，而血清中IL-10、IL-35和TGF-β1的表達均增加。根據上述研究基礎，我們推測可能是其他免疫調節(jié)性細胞(如Tregs、pDCs和MDSCs)對GBS患者血清中這些抑炎性細胞因子的分泌進行了代償。因此，GBS患者外周血Bregs與其他免疫調節(jié)性細胞之間的關系有待進一步研究。

我們的研究發(fā)現，與健康對照組相比，GBS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細胞的比例降低，而外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細胞和CD19+CD27hiCD38hi漿細胞占總B細胞的比例無顯著差異。與健康對照組相比，GBS患者血清IL-10、IL-35和TGF-β1水平顯著上調。

綜上所述，Bregs在GBS中是重要的負性自身免疫調節(jié)細胞，這增加了我們對GBS發(fā)病機制的認識。本研究的重要意義在于，聯合檢測分析外周血中CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細胞比例以及血清中抑炎性細胞因子IL-10、IL-35和TGF-β1水平，可以作為揭示GBS臨床特征及探討發(fā)病機制的重要方法。