陳光璋,范芳芳，梁坤鵬，韋 莉，3

(1.感染與免疫安徽省重點實驗室；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

蛋白質(zhì)、多糖以及各種因子的分泌是重要的生命活動。在細菌和真菌等微生物中，這些過程大多與細胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)有關(guān)[1-2]。EV是細胞主動分泌的具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)、納米到微米級大小的膜囊泡的統(tǒng)稱[3]。革蘭陰性菌EV起源于外膜，因此通常被稱為外膜囊泡(out membrane vesicle，OMVs)[4]。最早被發(fā)現(xiàn)存在于大腸埃希菌(E.coli)的培養(yǎng)基中。早期，人們一直認為OMVs是細菌生長的代謝產(chǎn)物。然而越來越多的研究證實，它是原核細胞有目的產(chǎn)生的納米結(jié)構(gòu)，發(fā)揮類似于真核生物外泌體的功能，可作為媒介在細菌和宿主之間傳遞細胞表面組分、毒力因子和抗原等生物信息[5-6]。

OMVs的提取是研究其在細菌毒力、耐藥以及細胞間通訊機制的基礎(chǔ)。本實驗以E.coli為實驗對象，利用超濾濃縮法和差速離心法提取OMVs，旨在分析不同方法的提取效率并比較其優(yōu)缺點以及對細胞存活率的影響，為建立高效的細菌OMVs制備方法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 來自蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院痰培養(yǎng)的E.coli，耐藥表型為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶陽性。

1.1.2 主要試劑和儀器 LB肉湯培養(yǎng)基(Solarbio，北京)；1×PBS緩沖液(Solarbio，北京)；BCA蛋白濃度定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，上海)；100 KDa超濾離心管(Minipore，美國)；超速離心管、超速離心機(BeckmanL-80XP，美國)和配套的70TI定角轉(zhuǎn)子，HT-7700透射電鏡(Hitachi，日本)，ZetaVIEW納米顆粒跟蹤分析儀(PARTICLEMETRIX，德國)，多功能酶標儀(Synerge II，美國Bio-Tex)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)及生長曲線的測定 凍存菌種接種于LB固體培養(yǎng)基，置37 ℃過夜活化、挑取單菌落轉(zhuǎn)種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，在200 rpm的轉(zhuǎn)速和37 ℃的溫度下培養(yǎng)過夜。從過夜培養(yǎng)的E.coli試管中按照1∶100的比例接種到含有250 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，以200 rpm轉(zhuǎn)速、37 ℃溫度條件培養(yǎng)過夜。定時取樣測定OD值，繪制生長曲線。

1.2.2 超濾濃縮法提取OMVs 細菌用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD 600為0.8時收集菌液，4 000×g，15 min；離心后取上清經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾除去細胞碎片等雜質(zhì)，收集濾液，用截留分子量為100 KDa的超濾管離心濃縮(4 000×g、4 ℃、5 min)，加PBS洗滌并重復(fù)此步驟重復(fù)2～3次，收集處于超濾管內(nèi)的液體，約為原體積的1/10。將濃縮后的上清轉(zhuǎn)移至無菌超速離心管，150 000×g，超速離心120 min，棄去上清，將沉淀重懸于400 μL PBS緩沖液中。

1.2.3 差速離心法提取OMVs 細菌用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD 600為0.8時收集菌液，4 000×g，15 min；離心后取上清經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，收集濾液轉(zhuǎn)移至超速離心管，150 000×g，離心120 min，棄去上清，將沉淀重懸于足量的PBS緩沖液中；再次150 000×g，超速離心120 min，棄去上清，將沉淀重懸于400 μL PBS緩沖液中。

1.2.4 BCA蛋白定量 用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定提取樣品的蛋白質(zhì)濃度。將試劑A與試劑B按體積比50∶1混合，配成BCA工作液。取5 mg/mL BSA蛋白標準溶液用PBS溶液配置至終濃度為1.0 mg/mL。用1×PBS緩沖液依照濃度梯度(0 μg/mL，25 μg/mL，125 μg/mL，250 μg/mL，500 μg/mL，750 μg/mL，1 000 μg/mL，1 500 μg/mL，2 000 μg/mL)配置BSA標準測定溶液，體積均為20 μL。將適當(dāng)體積的待測樣品移入微孔板中，并用PBS補足到20 μL，向微孔板中添加200 μLBCA工作液,混勻,37 ℃孵育30 min；測定A 562 nm處的吸光值；以不含BSA的樣品的光吸收度作為空白對照。標準曲線以A562為橫坐標，BSA含量為縱坐標，計算OMVs的蛋白濃度。以蛋白產(chǎn)率比每1010個細菌獲得的蛋白量(μg)計算OMVs產(chǎn)率(OD 600所對應(yīng)細菌量為2×109CFU/mL)。

1.2.5 透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)檢測OMVs形態(tài) 取10 μL OMVs滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液。隨后醋酸雙氧鈾10 μL滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液，常溫靜置數(shù)分鐘，待干燥后透射電鏡觀察形態(tài)，檢測成像。

1.2.6 納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle tracking analysis，NTA)技術(shù)檢測OMVs粒徑大小分布和濃度 將制備的OMVs懸液冰上放置，PBS稀釋后渦旋震蕩混勻，置樣本池中，進行粒度測量，Zetasizer軟件分析OMVs的直徑范圍。

1.2.7 RAW264.7細胞的復(fù)蘇與傳代 取出凍存于液氮中的RAW264.7細胞，于37 ℃水浴鍋孵育，復(fù)溫后吸取細胞懸液加入到含5 mL完全培養(yǎng)基(1%雙抗、10%FBS、90%DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基)的離心管中離心棄上清液，用1 mL的完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種于含完全培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。待細胞長到80%左右獲取細胞，洗滌離心后用新鮮完全培養(yǎng)基重懸細胞，加入到含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.8 CCK8法測OMVs對RAW264.7細胞存活率的影響 調(diào)整細胞濃度至5×104/mL，按100 μL/孔加入96孔板培養(yǎng)過夜，分別于各孔中加入不種方法提取的終濃度100 μg/mL OMVs，同時設(shè)對照組；置5%CO2，37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2 h。在酶標免疫檢測儀上以450 nm測定吸光度。細胞存活率(%)=[A(實驗)-A(空白)]/[A(對照)-A(空白)]×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用“均數(shù)±標準差”表示，組間比較采用配對t檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E.coli的生長曲線由E.coli的生長曲線(圖1)可見OD600為0.8時細菌處于對數(shù)生長期,OMVs提取實驗均采用此吸光度值的菌液操作。

圖1 E.coli生長曲線的測定

2.2 BCA法測定OMVs的蛋白濃度根據(jù)試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，標準方程為:y=1010.4x-37.498，r2=0.9951。通過待測樣品吸光度值計算出差速離心法和超濾濃縮法提取的OMVs產(chǎn)率，分別為(2.7±0.1)μg/1010CFU和(3.3±0.3)μg/1010CFU。超濾濃縮法提取的OMVs量明顯高于差速離心法提取的OMVs的量(P<0.05)(圖2)。

圖2 OMVs蛋白濃度測定

2.3 負染電鏡觀察OMVs的形態(tài)通過TEM對提取的OMVs進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn):兩種方法提取的OMVs均為脂質(zhì)雙分子層、大小不等的球狀囊泡結(jié)構(gòu)，背景干凈，形態(tài)典型(圖3)。

圖3 OMVs電鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

2.4 OMVs粒徑分布與濃度檢測結(jié)果顯示:差速離心法提取的OMVs粒徑峰值169.5 nm，平均粒徑(186.0±112.8)nm，主要分布在47.5～367.5 nm之間，直徑<247.5 nm囊泡數(shù)量占總量(82.3±4.6)%；超濾濃縮法提取的OMVs粒徑峰值144.8 nm，平均粒徑(170.6±71.7)nm，主要分布在77.5～327.5 nm之間，直徑<247.5 nm囊泡數(shù)量占總量(88.8±3.7)%(圖4，表1、2)。相對于差速離心法，超濾濃縮法提取的直徑<247.5 nm的囊泡法所占百分比更高(P<0.05)(圖5)。

圖4 NTA檢測OMVs粒徑分布察

圖5 小于247.5 nm的囊泡數(shù)量所占百分比

表1 NTA檢測差速離心法提取OMVs粒徑分布區(qū)間累計百分比

表1續(xù)表

表2 NTA檢測超濾法提取OMVs粒徑分布區(qū)間累計百分比

2.5 OMVs對RAW264.7細胞存活率的影響CCK8結(jié)果顯示:與空白組相比，兩種方法提取的OMVs(100 μg/mL)均對RAW264.7細胞存活率產(chǎn)生影響(P均<0.05)。差速離心法提取的OMVs作用后，細胞存活率為(84.0±4.6)%，超濾濃縮法提取的OMVs作用組細胞存活率為(74.1±6.6)，組間無顯著性差異(P>0.05)(圖6)。

圖6 OMVs對RAW264.7細胞存活率的影響

3 討論

OMVs是細菌生命活動中不斷從細胞表面脫落形成的功能性囊泡，內(nèi)含核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和代謝物等[7]。大量研究表明，幾乎所有革蘭陰性菌均能產(chǎn)生OMVs，其生物起源是一個精細、有選擇性的過程[8]。細菌通過釋放OMVs去除胞內(nèi)不必要物質(zhì)，以抵御外界應(yīng)激壓力。同時，OMVs在發(fā)病機制、細胞間通訊、生物膜形成以及基因水平轉(zhuǎn)移等方面也發(fā)揮重要作用[9]。

高效便捷的提取方法是研究OMVs生物學(xué)功能及應(yīng)用的基礎(chǔ)，目前常用的制備OMVs的方法多且各自存在優(yōu)缺點[10]，如何選擇滿足自身實驗需求的方法是研究者共同關(guān)心的問題。OMVs為細菌生長過程中分泌到菌體外的成分，本研究通過常規(guī)培養(yǎng)E.coli，獲取上清后用超濾濃縮法和差速離心法提 取OMVs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法均能夠成功提取OMVs，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)超濾濃縮法和差速離心法提取的OMVs形態(tài)上無明顯差異，均為直徑約20～250 nm的球狀立體膜結(jié)構(gòu)，且對細胞存活率的影響無差異。但差速離心法耗時較長，需要重復(fù)離心，提取的OMVs更易受到機械力影響而破裂，鏡下可見包膜不完整。NTA對OMVs表征進一步分析發(fā)現(xiàn)，兩種方法提取的OMVs粒徑分布不同，超濾濃縮法提取的OMVs平均粒徑更加集中，直徑<247.5 nm的囊泡數(shù)量占總量(88.88±3.78)%，高于差速離心法制備的OMVs。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)超濾濃縮法具有更高的提取效率，制備的OMVs完整性、純度和蛋白濃度均高于差速離心法。當(dāng)然，在進行OMVs研究時也應(yīng)充分考慮試驗需求，差速離心法利用樣品中各種組分的沉降系數(shù)不同依次去除不同雜質(zhì)，最終利用超高速離心力使OMVs沉淀實現(xiàn)分離制備的目的。因操作簡單，底物可重復(fù)利用等優(yōu)點成為分離提取OMVs最經(jīng)典的方法，適合于大體積樣本。超濾濃縮法則是通過使用截留分子量為100 KDa的超濾管進行樣品濃縮，提高了回收效率，并大大縮短離心時間，僅需2.5 h左右便可完成OMVs的提取，克服了差速離心技術(shù)的缺陷與不足，是一種操作方便、簡單易行的提取細菌OMVs的方法，具有良好的應(yīng)用前景。總之，研發(fā)新的制備方法或改良現(xiàn)有方法，使OMVs分離達到 “高純度、高效率 ”是未來的研究方向，可以為針對OMVs的生物學(xué)活性研究、以及以O(shè)MVs為靶點治療和預(yù)防感染性疾病奠定堅實的實驗基礎(chǔ)。