符禹玄，武 庚，侯廣玉，朱 梅，石莉莉，趙富生

(牡丹江醫(yī)學院1.第一臨床醫(yī)學院；2.基礎醫(yī)學院，黑龍江 牡丹江 157011)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，臨床上患者表現(xiàn)為脊髓受損平面以下感覺、運動以及自主神經(jīng)功能暫時或永久性喪失，甚至會危及生命[1]。SCI的治療一直是世界性難題，目前仍缺乏有效的治療方案。SCI發(fā)生后，在脊柱骨折或脫位等原發(fā)性損傷的基礎上，繼發(fā)局部組織出血、水腫、氧化應激、炎癥反應等一系列病理變化，加重神經(jīng)功能障礙[2]。小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內固有免疫細胞，越來越多研究者認為，小膠質細胞是神經(jīng)炎性反應的發(fā)動者和調控者[3]。研究表明，SCI后小膠質細胞活化、極化釋放腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等致炎因子和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，導致炎癥反應、神經(jīng)元凋亡和組織損傷[4]。因此，如何調控小膠質細胞極化，減輕炎癥反應，促進運動功能的恢復，被認為是改善SCI的有效干預手段。神經(jīng)調節(jié)蛋白-1(neureglin1，NRG-1)是一種含表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)結構域的跨膜信號蛋白，表達于心肌、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞等多種組織，在突觸塑型、髓鞘形成以及心肌發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[5]。研究表明，NRG-1含有α和β兩種EGF樣結構域，NRG-1β在神經(jīng)系統(tǒng)和心肌細胞內表達較高，而NRG-1α主要表達于乳腺組織[5]。研究發(fā)現(xiàn)，NRG-1通過與其受體ErbB酪氨酸激酶結合發(fā)揮生物學作用，如NRG-1/ErbB結構或功能發(fā)生異常，可誘發(fā)阿爾茨海默癥等多種神經(jīng)退行性疾病[6]。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，NRG-1能夠促進施萬細胞增殖、遷移和分化，參與神經(jīng)損傷的再生和修復過程[7]。然而，NRG-1是否能夠抑制小膠質細胞極化及炎癥反應，改善SCI后運動功能，目前尚不清楚。本研究通過建立大鼠SCI半橫切損傷模型，探討NRG-1對SCI的修復作用及相關機制，以期為臨床SCI治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡健康雄性SD大鼠36只，由牡丹江醫(yī)學院實驗動物中心提供，許可證號SYXK(黑)2019-006。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24 ℃，濕度42%～46%，晝夜12 h交替光照，自由攝食飲水。實驗過程符合國家及單位實驗動物管理和使用規(guī)定。

1.1.2 主要試劑與儀器 ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；兔抗鼠IBA1抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；重組人神經(jīng)調節(jié)蛋白-1β、ECL化學發(fā)光試劑盒、PVDF膜(上海碧云天生物技術有限公司)；TNF-α、IL-1β和IL-6試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；酶標儀(Bio-Tek公司)；激光共聚焦顯微鏡(Zeiss公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；Image-Pro PLUS圖像分析軟件(MeyerInstruments公司)。

1.2 方法

1.2.1 脊髓半橫切模型制備 參照文獻[8]，建立脊髓半橫切模型。戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取俯臥位，背部正中縱行切口鈍性分離筋膜及雙側椎旁肌，暴露T7-T9棘突、雙側椎板以及橫突，剪除T8棘突及棘突下椎板暴露脊髓，虹膜刀避開血管垂直刺入右側脊髓至椎管底部，刀鋒向右劃動至脊髓半橫斷。大鼠出現(xiàn)連續(xù)性鼠尾擺動，后肢痙攣性回彈，右后肢癱軟、肌張力消失、針刺無反應，提示造模成功。逐層縫合硬脊膜、肌肉、筋膜和皮膚，注青霉素(20萬U/kg)，2 次/d，連續(xù)3 d，將飼料和飲水置于動物可及范圍，保持墊料干燥。

1.2.2 動物分組及處理 將SD大鼠隨機分為假手術組(sham)、脊髓半橫切模型組(SCI)和治療組(NRG-1)，每組12只。sham組:僅行椎板切除術，不損傷脊髓；NRG-1組:脊髓右側半橫切后，尾靜脈注射100 μL NRG-1 β(10 μg/kg)，1次/d，連續(xù)注射4周；SCI組:脊髓右側半橫切后，尾靜脈注射等量PBS溶液。

1.2.3 BBB運動功能評分 術后第1、7、14、21、28天，各組隨機選取6只大鼠進行BBB評分。BBB運動功能評分范圍為0～21分，0分表示大鼠后肢癱瘓，21分為大鼠后肢運動功能正常。BBB評分采用雙盲、雙人獨立完成評分，結果取平均值。

1.2.4 Nissl染色 術后第28天，取各組大鼠用戊巴比妥鈉過量麻醉后，剖胸左心室灌注4%多聚甲醛，切取0.5 cm損傷節(jié)段脊髓，制備石蠟切片，經(jīng)脫蠟和水化后，將切片置Nissl染液染色。光學顯微鏡觀察脊髓組織神經(jīng)元形態(tài)結構變化以及尼氏體密度。

1.2.5 免疫熒光染色 術后第28天，采用戊巴比妥鈉過量麻醉處死大鼠，取損傷節(jié)段脊髓，制備冰凍切片，行免疫熒光染色。切片經(jīng)固定、打孔、封閉后，加兔抗大鼠IBA1一抗(稀釋度1∶200)，濕盒內4 ℃孵育過夜，次日加Cy3標記的二抗，DAPI染核，采集圖像并采用Image J軟件分析熒光強度。

1.2.6 Western blot蛋白檢測 取各組大鼠損傷節(jié)段脊髓提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白含量。通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白、轉模及封閉后，加iNOS(1∶1000)和β-actin(1∶2000)一抗，4 ℃孵育過夜，次日加二抗，37 ℃孵育2 h，滴加ECL發(fā)光試劑成像，應用ImageJ軟件分析目的蛋白條帶相對灰度值。

1.2.7 ELISA實驗 按照試劑盒說明書操作,檢測脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。標準品孔中加入標準品稀釋液，樣品孔中加入待測樣品及稀釋液，37 ℃孵育，加顯色劑和終止液，酶標儀在450 nm波長處測各孔光密度(OD)值。

1.3 統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”表示。BBB實驗數(shù)據(jù)采用多因素方差分析，組間不同時間點的多重比較采用LSD法；其余實驗組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NRG-1對SCI大鼠運動功能影響術前各組大鼠BBB評分均為21分。術后第7天和第14天，SCI組和NRG-1組BBB評分均逐漸增高，但兩組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。術后第21天和第28天，NRG-1組BBB評分顯著高于SCI組(P<0.05)，見圖1。

圖1 ConA誘導肝損傷模型小鼠血清ALT和AST變化

2.2 NRG-1對神經(jīng)元損傷的影響各組大鼠脊髓組織Nissl染色及尼氏體密度分析如圖2所示。SCI組脊髓組織空洞較多，神經(jīng)元破壞、溶解，尼氏體密度降低；經(jīng)NRG-1治療后，脊髓組織中空洞減少，神經(jīng)元形態(tài)結構完整，尼氏體密度明顯增加。

圖2 大鼠脊髓組織Nissl染色

2.3 NRG-1對小膠質細胞活化的影響各組大鼠脊髓組織IBA1免疫熒光染色以及熒光強度分析如圖3所示,與sham組相比，SCI組IBA1熒光強度值顯著增高(P<0.05);與SCI組相比，NRG-1組熒光強度值顯著降低(P<0.05)，但仍高于sham組(P<0.05)。

圖3 NRG-1對小膠質細胞活化的影響

2.4 NRG-1對小膠質細胞M1型極化的影響各組大鼠脊髓組織M1型小膠質標志蛋白iNOS分析如圖4示,與sham組相比,SCI組iNOS蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與SCI組相比,NRG-1組iNOS蛋白表達水平降低(P<0.05),但仍高于sham組(P<0.05)。

圖4 各組大鼠脊髓組織iNOS蛋白表達比較

2.5 NRG-1對炎癥因子表達的影響各組大鼠脊髓組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量如圖5所示。與sham組相比，SCI組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著增加(P<0.05)；與SCI組相比，NRG-1組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)，但仍高于sham組(P<0.05)。

圖5 NRG-1對大鼠脊髓組織炎癥因子表達的影響

3 討論

SCI是由交通事故、高空墜落、自然災害等因素引起的一類致殘率很高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病。目前，SCI治療多通過藥物或手術等方式緩解癥狀，延緩并發(fā)癥發(fā)生，難以從根本上恢復受損神經(jīng)功能，給患者身心造成極大傷害，同時也給社會和家庭造成巨大的經(jīng)濟負擔。據(jù)研究報道，我國每年遭受SCI困擾的患者約3～5萬人，且呈現(xiàn)逐年增加趨勢[9]。研究表明，NRG-1具有促進軸突再生以及髓鞘形成的作用，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中具有廣闊的應用前景[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過尾靜脈注射NRG-1能夠減輕SCI導致的運動功能障礙，促進大鼠后肢運動功能的恢復。有研究報道，鞘內注射NRG-1蛋白可以抑制損傷區(qū)脊髓組織膠質瘢痕形成，減輕局部炎癥反應，改善SCI后大鼠肢體運動功能[11]。在本研究中，尼氏染色結果顯示，NRG-1能夠減輕大鼠損傷區(qū)脊髓組織神經(jīng)元核固縮，恢復神經(jīng)元尼氏體密度。我們推測，NRG-1可能通過調節(jié)小膠質細胞極化，抑制炎癥反應發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

研究表明，小膠質細胞在神經(jīng)炎癥反應過程中發(fā)揮重要的作用。生理條件下，小膠質細胞處于靜息態(tài)，發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。在病理情況下，小膠質細胞迅速活化轉化成為具有遞呈抗原和釋放促炎癥細胞因子的經(jīng)典激活型(M1)小膠質細胞，吞噬異常蛋白、核酸和死亡細胞，增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)對病理性刺激的防御能力。然而，M1型小膠質細胞也具有誘導神經(jīng)元死亡、加重神經(jīng)炎性反應以及神經(jīng)組織損傷等神經(jīng)毒性作用。選擇性激活型(M2)小膠質細胞具有釋放營養(yǎng)因子和抗炎細胞因子，吞噬死亡細胞和異常蛋白，促進神經(jīng)元存活和組織修復，支持和保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)結構和功能完整性的作用[12]。本研究結果表明，NRG-1能夠抑制SCI誘導的小膠質細胞活化，并能夠抑制小膠質細胞M1型極化標志蛋白iNOS的表達，提示NRG-1具有調控小膠質細胞極化的功能。研究發(fā)現(xiàn)，SCI可誘導細胞產(chǎn)生大量炎癥細胞因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，這些炎癥細胞因子可刺激誘導其它炎癥介質產(chǎn)生。同時，這些炎癥細胞因子也可促進小膠質細胞活化，加重SCI后神經(jīng)組織的炎癥損傷[13]。本研究表明，損傷脊髓組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均出現(xiàn)不同程度升高，經(jīng)NRG-1處理后IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著降低。這些變化表明，SCI可導致促炎癥細胞因子大量產(chǎn)生，加重脊髓損傷局部炎癥反應，NRG-1能夠抑制IL-1β、IL-6、TNF-α產(chǎn)生，從而減輕SCI引起的神經(jīng)炎癥反應，發(fā)揮脊髓保護作用。

綜上所述，本研究證實NRG-1能夠促進SCI大鼠運動功能恢復，其作用機制可能與抑制小膠質細胞M1型極化，減輕炎性反應和改善神經(jīng)元損傷有關。本研究結果為SCI治療提供了一定的實驗依據(jù)。但NRG-1的神經(jīng)保護分子機制需進一步深入研究。