◎ 張 曉，葛 謙，賈 航，曾雪君，岳田利,4，袁亞宏,4

（1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品科技學(xué)院，江蘇 蘇州 215008；2.寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，寧夏 銀川 750002；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；4.西北大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710069）

黃豆醬在我國(guó)已經(jīng)有3 000 多年的歷史，因其在烹飪中可以顯著提高食品的鮮味，在東亞和東南亞國(guó)家深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。黃豆醬不僅含有豐富的有機(jī)酸、氨基酸、礦物質(zhì)和微生物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，還具有抗炎[3]、抗肥胖[4]和抗癌的功效[5]。

生產(chǎn)豆醬的原料、種曲、發(fā)酵條件及加工工藝對(duì)最終產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)都有重要影響[6]。傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬是以黃豆、淀粉為主要原料，采用自然接種的方式進(jìn)行制醅，經(jīng)過(guò)2 ～3 個(gè)月自然發(fā)酵成熟[7]。工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬多采用人工接種、控溫發(fā)酵的方式進(jìn)行，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品一致性較高，但由于發(fā)酵菌種單一、發(fā)酵時(shí)間短，存在風(fēng)味單一、滋味濃厚度不足等問(wèn)題。

有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸、脂肪酸等相對(duì)分子量較低的非揮發(fā)性化合物是構(gòu)成黃豆醬特殊風(fēng)味的重要味覺(jué)因子[8]，這些化合物部分來(lái)源于生產(chǎn)黃豆醬所使用的原料（如大豆、小麥、曲霉等），另一部分來(lái)源于生產(chǎn)過(guò)程中的酶促反應(yīng)和熱降解。同時(shí)，發(fā)酵和貯存過(guò)程中微生物代謝、原料水解產(chǎn)生的有機(jī)酸和氨基酸是醇類、酯類和醛類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體，對(duì)黃豆醬獨(dú)特的風(fēng)味及口感形成有重要作用[9]。為了探究不同加工工藝對(duì)黃豆醬品質(zhì)的影響，本研究采集了東北地區(qū)家庭傳統(tǒng)發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬樣品共49份，采用高效液相色譜和固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其有機(jī)酸、氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析獲得導(dǎo)致其品質(zhì)差異的主要物質(zhì)，為進(jìn)一步探究傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬特殊風(fēng)味的來(lái)源及工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬品質(zhì)提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用的49 份黃豆醬樣品均采自東北地區(qū)，其中13 份采自工廠（編號(hào)C1-C13），其余36 份樣品采自農(nóng)戶（編號(hào)T1-T36），樣品分布地區(qū)和類型如表1所示。所有樣品均由黃豆及小麥粉作為主要原料制成，樣品在分析前保存在4 ℃冰箱。

表1 黃豆醬樣品采集地區(qū)分布及數(shù)量表

色譜乙腈、甲醇，美國(guó)天地公司；磷酸、磷酸銨、三氯乙酸、鹽酸，色譜純，上海生工；磷酸氫二鈉、四硼酸鈉，分析純，上海阿拉??；有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，日本島津。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A 高效液相色譜，日本島津；QP2010 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津；GTR 16-2 高速冷凍離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；超純水機(jī)，南京軒科儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 有機(jī)酸含量的測(cè)定

①樣品預(yù)處理。取破碎均勻的樣品5 g，加蒸餾水定容至50 mL，超聲提取10 min，10 000×g離心10 min，取上清液2 mL，加入1 mol·L-1磷酸0.08 mL，蒸餾水定容到4 mL。②儀器測(cè)定。采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，色譜柱為Shimi-pack VP-DOS C18分析柱（250 mm×4.6 mm，4.5 μm，日本島津）。分析條件：流速0.7 mL·min-1，溫度40 ℃，流動(dòng)相0.01 mol·L-1磷酸銨（磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.7），PDA 檢測(cè)器檢測(cè)[10]。

1.3.2 氨基酸含量的測(cè)定

①樣品預(yù)處理。取破碎均勻的樣品5 g，加蒸餾水定容至50 mL，超聲提取10 min，10 000×g 離心10 min，取上清液進(jìn)行進(jìn)一步分析。②儀器測(cè)定。采用高效液相色譜按照日本島津氨基酸分析試劑盒（PN:AJS-01）的方法進(jìn)行分析[11]。取樣品濾液2 mL，加入5%三氯乙酸溶液5 mL，混勻，靜置60 min，蒸餾水定容至10 mL，離心5 min，上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)行高效液相色譜分析。日本島津高效液相色譜系統(tǒng)，配有LC-20AD 泵，SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20A 柱箱，SPD-M20A 紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器，Durashell AA 分析柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），柱溫50 ℃。流動(dòng)相A 為0.45% Na2HPO4·12H2O 和0.475%Na2B4O7·10H2O，用36%鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為8.2；流動(dòng)相B為甲醇-乙腈-去離子水(45∶45∶10，v∶v∶v)。梯度洗脫程序見(jiàn)表2，所有樣品進(jìn)樣量均為2 μL。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為338 nm 和262 nm，檢出限均為1 mg·L-1。

表2 氨基酸HPLC 分析梯度洗脫程序表

1.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)分析

采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)所有大豆醬樣品進(jìn)行揮發(fā)性成分分析[10]。將2 g 黃豆醬樣品放入20 mL 玻璃小瓶中，加入40 μL 的2-辛醇（最終濃度4.09×104μg·L-1）作為內(nèi)標(biāo)。采用固相微萃取取樣器，采用carboxen/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷纖維（美國(guó)色譜科公司），將揮發(fā)性化合物在相同溫度下富集15 min 后，在頂空40 ℃萃取20 min。將進(jìn)樣器插入氣相色譜儀進(jìn)樣器中，在250 ℃無(wú)分流進(jìn)樣模式下熱解吸3 min。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定和定量。采用DB-1 MS 色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）進(jìn)行分析，溫度程序?yàn)?0 ℃，保持3 min，4 ℃·min-1升溫至120 ℃，然后6 ℃·min-1升溫至240 ℃，保持9 min。1.3.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3 次。采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件包version 22 進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和非參檢驗(yàn)，p＜0.05 為樣本間有顯著差異；采用SIMCA 14.1 軟件正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），作圖采用OriginPro 2017。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中有機(jī)酸和氨基酸的差異分析

2.1.1 有機(jī)酸

有機(jī)酸是黃豆醬呈現(xiàn)酸味的主要原因，黃豆醬中的糖酸比決定了產(chǎn)品的酸甜口感。研究表明，發(fā)酵醬類食品中的有機(jī)酸主要為草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等[8]。圖1 所示為傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中8 種主要有機(jī)酸的含量對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)乳酸、乙酸和蘋果酸是黃豆醬中主要的有機(jī)酸，草酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸和丙酮酸的含量較低。丙酮酸是三羧酸循環(huán)的重要原料，也是參與形成氨基酸的原料[12]，因此在樣品中很難被檢測(cè)到。傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中的有機(jī)酸含量顯著高于工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬，其中乳酸、乙酸、蘋果酸和檸檬酸的平均含量分別達(dá)到4.49 mg·g-1、2.53 mg·g-1、1.37 mg·g-1和1.08 mg·g-1。工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中含量最高的有機(jī)酸為乳酸（1.53 mg·g-1），其次為酒石酸（1.10 mg·g-1）和乙酸（0.54 mg·g-1）。這可能是由于傳統(tǒng)黃豆醬采用混合菌種發(fā)酵，乳酸菌和乳酸桿菌的代謝活性更高[13-14]，并且發(fā)酵周期長(zhǎng)，積累了更多酸類物質(zhì)[15]。

圖1 傳統(tǒng)發(fā)酵（T）和工業(yè)生產(chǎn)（C）黃豆醬有機(jī)酸含量圖

2.1.2 氨基酸

氨基酸對(duì)發(fā)酵食品的味道有著至關(guān)重要的作用，依據(jù)氨基酸呈現(xiàn)出味道的不同，可以分為4 類。呈現(xiàn)鮮味的谷氨酸、天冬氨酸，呈現(xiàn)甜味的絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和丙氨酸，呈現(xiàn)苦味的纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、精氨酸、組氨酸和酪氨酸，以及對(duì)味道沒(méi)有貢獻(xiàn)的半胱氨酸[8,12,16]。采用高效液相色譜對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬樣品中的17 種氨基酸進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2 所示。傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中氨基酸總量平均值為26.96 mg·g-1，略低于工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬（31.56 mg·g-1）。脯氨酸在兩種黃豆醬中的含量最高，在工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中達(dá)到4.99 mg·g-1，傳統(tǒng)發(fā)酵樣品中為3.93 mg·g-1；其次為谷氨酸，在兩類樣品中的平均含量分別為4.59 mg·g-1和3.73 mg·g-1；丙氨酸和亮氨酸的含量也相對(duì)較高。鮮味氨基酸在工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬的含量高于傳統(tǒng)發(fā)酵氨基酸樣品，可能是由于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中添加了鮮味氨基酸進(jìn)行調(diào)味。樣品中半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸和酪氨酸的含量極低，對(duì)風(fēng)味的影響較小。

圖2 傳統(tǒng)發(fā)酵（T）和工業(yè)生產(chǎn)（C）黃豆醬游離氨基酸含量圖

從兩類樣品中有機(jī)酸和氨基酸含量的分析中不難發(fā)現(xiàn)，即使同組樣品中其含量也有較大差異，這是由于黃豆醬生產(chǎn)過(guò)程中原料、發(fā)酵微生物和發(fā)酵條件均會(huì)對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味產(chǎn)生影響[13]；尤其是傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬，由于每家每戶所采用的原料、發(fā)酵工藝均不盡相同，導(dǎo)致最終產(chǎn)品的差異較大，這也是傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬風(fēng)味多樣的來(lái)源。

2.1.3 有機(jī)酸和氨基酸的差異分析

采用OPLS-DA 分析傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中的關(guān)鍵滋味物質(zhì)，并進(jìn)一步研究這些非揮發(fā)性化合物與不同工藝之間的關(guān)系。在OPLS-DA 模型中，將樣品中26 種有機(jī)酸和氨基酸含量指定為x矩陣，樣品指定為y矩陣。從圖3 中可看出，兩類黃豆醬樣品的分布有明顯差異，傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬樣品主要分布在x軸的負(fù)半軸，分布較分散；而工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬分布在x軸的正半軸區(qū)域，分布較為集中，說(shuō)明其有機(jī)酸和氨基酸含量一致性較高。

圖3 氨基酸、有機(jī)酸含量與樣品的OPLS-DA 分析雙標(biāo)圖

為了進(jìn)一步明確傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中的關(guān)鍵差異物質(zhì)，對(duì)樣品中有機(jī)酸和氨基酸的VIP值進(jìn)行計(jì)算，化合物的VIP 值如圖4 所示，通常VIP值大于1 的化合物被認(rèn)為是對(duì)樣品間差異有重要貢獻(xiàn)。從圖4 中可以看出乳酸、乙酸、谷氨酸、蘋果酸、天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸、絲氨酸和檸檬酸的VIP 值大于1，說(shuō)明傳統(tǒng)發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中的這9 種非揮發(fā)性物質(zhì)可能是造成兩類黃豆醬味道差異的關(guān)鍵化合物。結(jié)合有機(jī)酸和氨基酸含量分析結(jié)果，可推測(cè)乳酸、乙酸、谷氨酸、蘋果酸和丙氨酸是導(dǎo)致傳統(tǒng)發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬風(fēng)味差異的主要非揮發(fā)性物質(zhì)。

圖4 傳統(tǒng)發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬風(fēng)味差異貢獻(xiàn)VIP 成分圖

2.2 傳統(tǒng)發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異分析

在傳統(tǒng)發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬樣品中共檢測(cè)到203 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，被分為10 類，包括60 種酯、37 種醇、19 種醛、19 種酮、18 種萜烯、17 種酸、14 種呋喃（酮）、8 種酚、7 種吡嗪和4 種含硫化合物。其中，傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中檢測(cè)到揮發(fā)性風(fēng)味化合物162 種，高于工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中的108 種。這些化合物均在之前的研究中被報(bào)道為醬油或豆醬的風(fēng)味化合物[17-20]。各類揮發(fā)性風(fēng)味化合物的相對(duì)濃度如表3 所示，傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的平均含量為23 979.3 μg·kg-1，顯著高于工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬。傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中酯類化合物含量最高，平均值達(dá)到11 346.3 μg·kg-1，其次為醇類、酸類和醛類；工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中醇類化合物含量最高，其次為酯類、醛類和酸類。其中，醇類、酯類、酸類、酮類、烯萜類和呋喃（酮）類的相對(duì)濃度在傳統(tǒng)發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中存在顯著差異。傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中酯類、酸類和酮類的含量顯著高于工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬，這可能是由于傳統(tǒng)黃豆醬的發(fā)酵周期更長(zhǎng)，有研究表明醬類發(fā)酵和貯存過(guò)程有利于脂肪酸乙酯類化合物的積累[21]。工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中醇類、萜類和呋喃（酮）類的含量顯著高于傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬，這是由于工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬為了提高產(chǎn)品風(fēng)味、延長(zhǎng)貨架期，在發(fā)酵結(jié)束后普遍存在加熱工序，促進(jìn)了呋喃（酮）類、斯托克醛、含硫化合物和α-二羰基化合物等風(fēng)味化合物的產(chǎn)生[18,22]。

表3 傳統(tǒng)發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量表

黃豆醬是以黃豆、淀粉為主要原料，經(jīng)過(guò)霉菌、酵母菌和乳酸菌等多種微生物協(xié)同發(fā)酵而成的，其發(fā)酵過(guò)程主要包括制曲和醬醅發(fā)酵兩個(gè)階段，發(fā)酵品質(zhì)的優(yōu)劣是決定產(chǎn)品風(fēng)味的關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)黃豆醬采用日曬夜露的方式進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度受天氣變化影響大，顯著影響了美拉德反應(yīng)和微生物的代謝活動(dòng)[19]；與工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程相比，其發(fā)酵條件溫和、緩慢，有利于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的積累。另外，工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬通過(guò)添加單一或幾種微生物進(jìn)行發(fā)酵[23]，而傳統(tǒng)黃豆醬采用自然接種的方式進(jìn)行制曲發(fā)酵，豐富的微生物群落是其多樣的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的來(lái)源[24-25]。因此，傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量更加豐富，為其風(fēng)味的獨(dú)特性和多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

非揮發(fā)性化合物是構(gòu)成食品味覺(jué)的重要因素，也是導(dǎo)致不同食品味道差異的主要原因，它們主要與5 種類別的味覺(jué)有關(guān)：甜、咸、酸、苦和鮮味[8]。谷氨酸是公認(rèn)的鮮味化合物，味精（谷氨酸鈉）在日常烹飪中經(jīng)常作為鮮味添加劑使用。其他的一些鮮味化合物包括天冬氨酸、核苷酸等在發(fā)酵醬類食品中也天然存在，有研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)醬油中的味覺(jué)活性氨基酸和核苷酸化合物的含量更高[26]。有機(jī)酸類是食品酸味的來(lái)源，KONG 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸和焦谷氨酸是中式醬油中主要的有機(jī)酸，有助于增加酸味，保證了醬油口感的平衡。另外，丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸呈現(xiàn)類似糖類的甜味，在黑醬油和日本醬油中含量更高。本研究中發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)黃豆醬中的乳酸、乙酸和丙氨酸的含量顯著高于工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬，這可能是傳統(tǒng)黃豆醬口感更加濃厚、平衡的原因之一。

揮發(fā)性化合物在食品風(fēng)味中的重要性和作用方式已經(jīng)被廣泛報(bào)道，醬類中的揮發(fā)性化合物含量特別豐富，研究人員已在不同類型的醬類食品中發(fā)現(xiàn)超過(guò)300 種具有香氣活性的揮發(fā)性化合物，其中許多都與醬類的主要香氣有關(guān)：醛類是麥芽香氣的主要來(lái)源，酮類則主要呈現(xiàn)焦糖味，而醇類、酯類是花香味和果香味的主要來(lái)源[13]。2-苯乙醇有玫瑰般的香氣，是與醬類花香有關(guān)的主要化合物之一，主要在傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程中由丙氨酸在酵母的代謝過(guò)程中產(chǎn)生的，當(dāng)醬醪的發(fā)酵周期較長(zhǎng)時(shí)就更加豐富[27]。醬類中最豐富的酯類是2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和3-甲基乙酸丁酯，它們會(huì)帶來(lái)甜味和水果味，酯類與酵母的酯類代謝有關(guān)，酵母代謝產(chǎn)生大量的酸和醇類，這些酸和醇類隨后發(fā)生酯化反應(yīng)生成酯類[13]。FENG 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，延長(zhǎng)發(fā)酵醬的陳化期有助于積累更加豐富的酯類物質(zhì)。傳統(tǒng)黃豆醬采用自然接種的方式制曲，發(fā)酵菌種更加豐富，是其產(chǎn)生多樣風(fēng)味的重要原因。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中的有機(jī)酸含量顯著高于工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬，尤其是乳酸（4.49 mg·g-1）、乙酸（2.53 mg·g-1）和蘋果酸（1.37 mg·g-1）；氨基酸總量平均值為26.96 mg·g-1，略低于工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬（31.56 mg·g-1），脯氨酸、谷氨酸在兩類黃豆醬中均為含量最高的氨基酸；傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的平均含量為23 979.3 μg·kg-1，高于工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬（17 672.3 μg·kg-1），其中酯類、酸類和酮類的含量顯著高于工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬；統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明乳酸、乙酸、谷氨酸、蘋果酸、丙氨酸、醇類、酯類和酸類可能是導(dǎo)致傳統(tǒng)發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬風(fēng)味差異的主要物質(zhì)，為進(jìn)一步探究傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬特殊風(fēng)味的來(lái)源及工業(yè)生產(chǎn)黃豆醬品質(zhì)提高提供參考。