◎ 鄭 琰，趙麗娟

（普洱學(xué)院，云南 普洱 665000）

咖啡是眾多消費(fèi)者喜愛的飲品，其營養(yǎng)價(jià)值一直備受關(guān)注，尤其是咖啡豆中所含的大量多酚類化合物已成為關(guān)注的重點(diǎn)[1]?？Х榷怪械幕钚晕镔|(zhì)極其豐富，綠原酸是其主要生物活性成分之一，具有降血壓、抗氧化、抗病毒、清除自由基等功效，常應(yīng)用于食藥、化工等行業(yè)[2-4]。綠原酸在不同的植物中含量不同，以杜仲葉、蒲公英、葵花籽、咖啡豆中綠原酸類似物的含量較高[5-7]。綠原酸在新鮮咖啡豆中含量占2%～8%，烘焙過后含量會(huì)因發(fā)生美拉德反應(yīng)、焦糖化等化學(xué)反應(yīng)降低。

目前國內(nèi)以咖啡豆作為研究對(duì)象提取綠原酸的工藝研究相對(duì)較少，云南咖啡年產(chǎn)量位居全國前列，對(duì)咖啡豆中綠原酸提取工藝進(jìn)行研究，提高綠原酸的產(chǎn)率具有很大的研究意義，有必要探究適合于云南咖啡豆中綠原酸提取的有效方法。相較于傳統(tǒng)單一的溶劑提取技術(shù)，微波技術(shù)作為一種新發(fā)展起來的加熱技術(shù)，具有提取速度快、對(duì)樣品破壞小、體系受熱均勻等特點(diǎn)[8-9]。作為新型的溶劑萃取分離技術(shù)，雙水相萃取根據(jù)組分在兩相間的選擇性分配從而達(dá)到目標(biāo)成分分離的目的，提取過程中能有效保護(hù)目標(biāo)成分的生物活性，并且雙水相萃取操作簡單、反應(yīng)速度快、選擇性強(qiáng)、成本低、破壞小，對(duì)于天然活性物質(zhì)的分離純化，其效率更高，并且不會(huì)殘留有機(jī)溶劑造成危害[10-12]。雙水相萃取體系，若加以微波輔助，能有效提高提取率、減少反應(yīng)時(shí)間和萃取成本，并且安全、環(huán)保[13-16]。

本文根據(jù)雙水相的特點(diǎn)，采用微波技術(shù)協(xié)同乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取云南小?？Х榷怪械木G原酸，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取體系，為云南小?？Х戎芯G原酸的提取奠定理論基礎(chǔ)，為咖啡豆中的綠原酸資源利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

試劑：無水乙醇（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸氫二鉀（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）。

儀器：紫外-可見分光光度計(jì)[UV-2600，島津企業(yè)管理（中國）有限公司]；格蘭仕微波爐（P70F20CN3LHP3，廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司）。

咖啡豆樣品：購于云南某咖啡公司，用蒸餾水將咖啡豆洗凈，烘干，取出后粉碎成粉末，過30 目篩，裝袋密封備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確移取不同體積的100 μg·mL-1綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成濃度為0 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、8.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在331 nm 波長處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 咖啡豆綠原酸含量的測(cè)定

按一定比例配制乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系，加入準(zhǔn)確稱取的咖啡豆粉末樣品，在一定微波功率下加熱萃取，離心，取上清液稀釋定容，在331 nm 波長下測(cè)其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到樣品溶液中綠原酸濃度，按下式計(jì)算出樣品的綠原酸提取率。

式中：X為綠原酸的提取率，%；c為樣品中綠原酸濃度，μg·mL-1；V為樣液體積，mL；n為提取液的稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取咖啡粉末樣品1.000 0 g，在固定其他因素不變的條件下，分別探討不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（60%、65%、70%、75%、80%、85%）、不同磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度（0.1 g·mL-1、0.2 g·mL-1、0.3 g·mL-1、0.4 g·mL-1、0.5 g·mL-1、0.6 g·mL-1）、不同料液比（1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70）、不同微波功率（210 W、280 W、350 W、420 W、490 W、700 W）、不同微波時(shí)間（10 s、15 s、20 s、25 s、30 s、35 s）對(duì)小?？Х染G原酸提取效果的影響，并按照1.2.2方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算綠原酸提取率。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究采用Design Expert 8.0.6.1 軟件，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度、料液比、微波時(shí)間為變量值，以綠原酸提取率為響應(yīng)值，建立模型，進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)響應(yīng)曲面圖和等高線圖進(jìn)行分析，以獲取優(yōu)化參數(shù)，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

如圖1 所示，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.055 9x-0.004 1，相關(guān)系數(shù)值為0.999 7，說明線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析研究，結(jié)果可靠。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由圖2 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%時(shí)，咖啡豆綠原酸提取率得到最大值，為4.05%，故初步選取75%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響

2.2.2 磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度

由圖3 可知，磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度在0.2 g·mL-1時(shí)達(dá)到最大值4.09%，故初步選取0.2 g·mL-1為最佳磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度。

圖3 磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度對(duì)綠原酸提取率的影響

2.2.3 料液比

由圖4 可知，咖啡豆綠原酸提取率在一定的料液比條件范圍內(nèi)波動(dòng)，當(dāng)物料與溶劑的比例在1 ∶50（g ∶mL）時(shí)，提取率達(dá)到在此范圍內(nèi)的最大值4.26%，而后逐步降低，故初步選取1 ∶50（g ∶mL）為最佳料液比。

圖4 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

2.2.4 微波功率

由圖5 可知，微波功率在210 ～280 W，咖啡豆中綠原酸的提取率急劇增加，于280 W 達(dá)到最大值4.33%，故初步選取280 W 為最佳微波功率。

圖5 微波功率對(duì)綠原酸提取率的影響

2.2.5 微波時(shí)間

由圖6 可知，微波時(shí)間在10 ～15 s 內(nèi)，咖啡豆綠原酸的提取率急劇升高且在15 s 時(shí)達(dá)到了整個(gè)時(shí)間研究范圍內(nèi)的最大值4.44%。故初步選取15 s 為最佳微波時(shí)間。

圖6 微波時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

綜上所述，初步選取75% 乙醇體積分?jǐn)?shù)、0.2 g·mL-1磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度、1 ∶50 料液比、280 W 微波功率、15 s 微波時(shí)間的工藝條件用于后續(xù)優(yōu)化研究。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以咖啡豆中綠原酸提取率為因變量，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度（B）、料液比（C）、微波時(shí)間（D）4 個(gè)因素為自變量，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析水平實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)水平見表1，優(yōu)化咖啡豆中綠原酸的提取條件。按照軟件所設(shè)計(jì)的各因素條件進(jìn)行試驗(yàn)，如表2 所示，計(jì)算出相應(yīng)綠原酸提取率。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

2.3.2 回歸方程和方差分析

利用Design Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行多元回歸方程擬合方差分析，得到綠原酸的提取率（響應(yīng)值E）的回歸方程為

E=4.48+0.080A-0.046B+0.061C+0.11D-0.078AB+0.013AD-0.043BC+0.067BD+0.030CD-0.15A2-0.026B2-0.076C2-0.17D2

由表3 可知，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腇值為28.52；回歸方程達(dá)到顯著（P值＜0.000 1），決定系數(shù)R2=0.932 2，說明回歸模型可靠。由表中的F值的大小可以看出這4 個(gè)因素對(duì)綠原酸提取率影響程度為微波時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度。

表3 回歸方程的方差分析表

2.3.3 響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面圖中圖形曲面坡度的大小、等高線的形狀和密集程度能直觀反映出兩個(gè)單因素之間的交互作用大小[17]。各個(gè)因素之間的交互作用對(duì)綠原酸提取率的影響見圖7 和圖8，可以據(jù)此分析4 個(gè)單因素的交互作用。

圖7 所示為乙醇體積分?jǐn)?shù)分別與磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度、料液比、微波時(shí)間兩兩之間對(duì)咖啡豆中綠原酸提取率的交互影響。①比較乙醇體積分?jǐn)?shù)與磷酸氫二鉀濃度的交互影響可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，綠原酸的提取率變化幅度更大，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)相較于磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度對(duì)響應(yīng)值的影響更為顯著。②在乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比兩個(gè)因素的交互影響圖中，咖啡豆綠原酸提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化的曲面較料液比變化曲面陡峭，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響大于料液比的影響。③比較乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波時(shí)間兩個(gè)因素的交互影，綠原酸提取率隨兩因素條件的變化均呈先增加后減小的趨勢(shì)，微波時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響較乙醇體積分?jǐn)?shù)稍大。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與其他因素的兩兩交互影響圖

圖8 所示為料液比、微波時(shí)間、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3 個(gè)因素兩兩之間對(duì)咖啡豆中綠原酸提取率的交互影響。比較3 個(gè)因素對(duì)咖啡豆中綠原酸提取率的兩兩交互影響，可知料液比對(duì)咖啡豆中綠原酸提取率的影響大于磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度；微波時(shí)間對(duì)咖啡豆綠原酸提取率的影響明顯大于磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度的影響；微波時(shí)間對(duì)咖啡豆綠原酸提取率的影響大于料液比的影響。

圖8 料液比、微波時(shí)間、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3 個(gè)因素的兩兩交互影響圖

綜上所述，通過比較4 個(gè)因素相互作用，它們對(duì)咖啡豆中綠原酸的提取率影響大小排列順序結(jié)果與回歸方程的方差分析表結(jié)果一致，微波時(shí)間對(duì)咖啡豆綠原酸提取率的影響最大，磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度的影響最小。

2.3.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化、預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行分析，能夠得到提取云南小粒咖啡豆綠原酸的最優(yōu)工藝條件，以及最佳提取率的預(yù)測(cè)值，為了證明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確度，在最佳預(yù)測(cè)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到綠原酸平均提取率為4.55%，驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值4.54%相近，證明最佳預(yù)測(cè)條件下的工藝條件是合理的。

3 結(jié)論

本文研究了微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取云南小?？Х榷怪芯G原酸的工藝條件，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化法設(shè)計(jì)模型，進(jìn)行線性回歸方程和二項(xiàng)式擬合，得到提取云南小?？Х染G原酸的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為76.98%，磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度為0.14 g·mL-1，料液比為1 ∶54.97，微波功率為280 W，微波時(shí)間為15.48 s；在該優(yōu)化條件下得到的云南小粒咖啡豆中綠原酸提取率為4.54%，與預(yù)測(cè)值4.55%相近，說明該方法對(duì)提取咖啡豆中的綠原酸效果顯著，本研究方法采用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取云南小?？Х榷怪芯G原酸具有一定可行性，為云南小?？Х戎芯G原酸的提取及相關(guān)資源開發(fā)利用提供一定理論參考。