鐘 環(huán) 陳海聰 劉田豐 楊樹凱 魏 波 歐陽漢斌

（廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨科中心關節(jié)外科，湛江524000）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性疾病，以慢性炎癥、滑膜細胞增生異常、關節(jié)腫脹壓痛為特征，發(fā)病機制尚不清楚［1］。早期診斷、新藥物及治療方案能夠有效改善RA 患者預后［2］。但部分患者對治療無反應，隨著病程發(fā)展，可能導致患者殘疾［3］。因此，尋找治療RA的新靶點勢在必行?；こ衫w維細胞（synovial fi?broblasts，SFs）是滑膜內膜重要組成。RA 期間，SFs過度激活導致薄滑膜增生并形成血管翳樣結構。RA 早期階段包括滑膜中存在活化的SFs，伴有侵襲性表型，如過度增殖、抑制凋亡等［4］。但SFs 在RA發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚未闡明。目前治療策略并不針對活化的SFs。因此，了解異常激活SFs的潛在機制有助于識別新的診斷標志物和治療靶點。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度超過200個核苷酸的轉錄物，通過調節(jié)SFs增殖和凋亡等參與RA 發(fā)生［5］。微小RNA（microRNA，miRNA）是另一類非編碼RNA，在自身免疫病中表達失調［6］。lncRNA-miRNA-mRNA 調控網(wǎng)絡在多種疾病中發(fā)揮關鍵作用，其中l(wèi)ncRNA 已被證明具有miRNA海綿功能［7］。最近研究表明，lnc AL928768.3在RA 滑膜組織標本中的表達明顯高于對照，且lnc AL928768.3 是RA 危險性和活動性的新生物標志物［8］。但lnc AL928768.3 在RA 患者SFs 中的作用尚不清楚。本研究通過生物信息學軟件LncBase Predicted v.2和TargetScan預測發(fā)現(xiàn)，lnc AL928768.3與miR-92a-3p及miR-92a-3p與ADAM10 存在特異性結合位點，因此，本研究擬探討lnc AL928768.3通過miR-92a-3p/ADAM10 軸調控RA-SFs 增殖和凋亡的機制，為RA治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 28 例RA 患者滑膜組織取自廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院行膝關節(jié)置換術或膝關節(jié)滑膜切除術的患者，入選患者無其他關節(jié)異?；蛉硇约膊　Ａ砣?8 例無慢性或急性關節(jié)相關疾病膝關節(jié)創(chuàng)傷患者的滑膜組織作為健康對照。標本采集后立即使用生理鹽水沖洗干凈，液氮中保存。本研究受試者知情同意，并經(jīng)廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理會批準。

1.1.2 試劑 RA-SFs 細胞系MH7A 購自美國ATCC；RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；lnc AL928768.3 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、ADAM10 siRNA 和siRNA control、lnc AL928768.3 過表達載體質粒和pcDNA3.1 空載體質粒、miR-92a-3p mimics 和mimics control、miR-92a-3p inhibitors 和inhibitors control 購自上海吉瑪制藥；Lipofectamine3000 脂質體購自美國Invitrogen 公司；MTT 試劑購自美國Amresco 公司；Trizol 試劑購自北京索萊寶；逆轉錄試劑盒、qPCR 檢測試劑盒購自賽默飛世爾；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購 自 日 本TaKaRa；ADAM10、PCNA、Cleaved Cas?pase-3單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國CST 公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒購自上海碧云天。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉染和分組 采用含10%胎牛血清及100 U/ml青-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MH7A 細胞，培養(yǎng)條件為：5%CO2、37 ℃、95%濕度。對數(shù)期MH7A細胞以1×105個/孔接種至6孔板，培養(yǎng)過夜，細胞60%匯合時轉染，根據(jù)Lipofectamine3000說明書將lnc AL928768.3 siRNA、ADAM10 siRNA、lnc AL928768.3過表達載體質粒、miR-92a-3p mimics、miR-92a-3p inhibitors 及相應陰性對照轉染至MH7A 細胞，6 h 后更換新的RPMI1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別記為si-AL928768.3 組、si-NC 組、si-AL928768.3+anti-miR-92a-3p 組、si-AL928768.3+anti-miR-NC 組、si-ADAM10 組、si-ADAM10+antimiR-92a-3p 組、si-ADAM10+AL928768.3 組，未轉染的MH7A細胞記為Mock組。

1.2.2 qPCR檢測lnc AL928768.3和miR-92a-3p表達 采用Trizol 試劑提取滑膜組織和轉染48 h 的各組MH7A 細胞總RNA，測定RNA 濃度和純度，逆轉錄合成cDNA，qPCR 試劑盒進行反應，擴增結束后分 析 樣 品Ct 值，2-ΔΔCt計 算lnc AL928768.3 和miR-92a-3p 表達，內參基因分別為GAPDH 和U6，引物序列為lnc AL928768.3 F：5'-CGTGACCTCTGTGGCT?GCTA-3'，lnc AL928768.3 R：5'-TTGTGATGTTG?GCGGTTAGTGG-3'；GAPDH F：5'-GAGTCCACTG?GCGTCTTCAC-3'；GAPDH R：5'-ATCTTGAGGCT?GTTGTCATACTTCT-3'；miR-92a-3p F：5'-CTCAACT?GGTGTCGTGGAGT-3'；miR-92a-3p R：5'-GCAATTCAGTTGATACAGGCCG-3'；U6 F：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；U6 R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因實驗 根據(jù)生物信息學在線數(shù)據(jù)庫LncBase Predicted v.2 和TargetScan預測結果，將與miR-92a-3p 結合位點的靶序列分別插入熒光素酶報告載體，構建lnc AL928768.3 野生型（lnc AL928768.3-Wt）和突變型（lnc AL928768.3-Mut）及ADAM10 野生型（ADAM10-Wt）和突變型（ADAM10-Mut）重組熒光素酶報告載體質粒，采用Lipofectamine3000分別將重組載體質粒分別與miR-92a-3p mimics 或mimics control 共轉染至MH7A 細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組MH7A 細胞，根據(jù)雙熒光素酶報告基因試劑盒分別測定螢火蟲和海腎熒光值，分別計算各組MH7A細胞相對熒光素酶活性。

1.2.4 MTT 檢測細胞增殖 對數(shù)期MH7A 細胞接種至96孔板，接種密度為5×103個/孔，按1.2.3 轉染，48 h后除去舊培養(yǎng)液，添加新的培養(yǎng)液，20 μl/孔添加MTT溶液繼續(xù)孵育4 h，添加150 μl二甲基亞砜溶解沉淀，酶標儀測定490 nm 處光密度（OD）值，實驗重復3次，以OD值評估各組MH7A細胞增殖能力。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 各組MH7A細胞轉染48 h，胰蛋白酶消化細胞，收集約6×105個細胞，PBS 洗滌數(shù)次，添加適量結合緩沖液重懸細胞，添加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI充分混勻，室溫避光孵育15 min，加入適量細胞懸液，流式細胞儀檢測，Cell Quest 軟件分析MH7A 細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測ADAM10、PCNA和Cleaved Caspase-3 蛋白表達 各組MH7A 細胞轉染48 h 后以RIPA 裂解液于冰上裂解，離心提取總蛋白，采用BCA 蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白含量，采用SDSPAGE 電泳分離蛋白，電轉至硝酸纖維素膜，封閉2 h，將膜與ADAM10、PCNA、Cleaved Caspase-3 和內參GAPDH 一抗共同孵育，4 ℃搖床過夜，次日取出膜與二抗孵育2 h，化學發(fā)光試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J 軟件分析各條帶灰度值，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RA患者滑膜組織lnc AL928768.3和miR-92a-3p表達 qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)，RA 患者滑膜組織中l(wèi)nc AL928768.3 表達明顯高于健康對照（P＜0.05），而miR-92a-3p表達明顯低于健康對照（P＜0.05，表1）。

表1 兩組滑膜組織中l(wèi)nc AL928768.3 和miR-92a-3p 表達（±s，n=28）Tab.1 Expressions of lnc AL928768.3 and miR-92a-3p in synovial tissues of two groups（±s，n=28）

表1 兩組滑膜組織中l(wèi)nc AL928768.3 和miR-92a-3p 表達（±s，n=28）Tab.1 Expressions of lnc AL928768.3 and miR-92a-3p in synovial tissues of two groups（±s，n=28）

Note：Compared with healthy control group，1）P＜0.05.

Healthy control RA synovial tissue t P 1.00±0.10 3.52±0.341）37.626 0.000 1.00±0.09 0.37±0.041）33.848 0.000images/BZ_26_1285_1872_2248_1931.png

2.2 lnc AL928768.3 靶向調控miR-92a-3p 表達生物信息學LncBase Predicted v. 2 在線數(shù)據(jù)庫預測結果顯示，lnc AL928768.3 與miR-92a-3p 存在特異性結合位點（圖1）。雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，與miR-NC組相比，miR-92a-3p組AL928768.3-Wt細胞相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而AL928768.3-Mut 細胞相對熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05，表2）。

表2 各組細胞相對熒光素酶活性比較（±s）Tab.2 Comparison of relative luciferase activity of cells in each group（s）

表2 各組細胞相對熒光素酶活性比較（±s）Tab.2 Comparison of relative luciferase activity of cells in each group（s）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

images/BZ_26_1281_2897_2240_2964.png

圖1 lnc AL928768.3和miR-92a-3p的互補堿基序列Fig.1 Complementary base sequence between lnc AL928-768.3 and miR-92a-3p

2.3 抑制lnc AL928768.3 對MH7A 細胞增殖和凋亡的影響 qPCR、MTT、流式細胞術和Western blot檢測結果顯示，與Mock 組和si-NC 組相比，si-AL928768.3 組MH7A 細 胞lnc AL928768.3 表 達 明顯下調（P＜0.05），OD 值及PCNA 表達均明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率、miR-92a-3p 和Cleaved Cas?pase-3 表達均明顯升高（P＜0.05）；Mock 組和si-NC組以上指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2、表3）。

表3 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、lnc AL92±s）Tab.3 Comparison of OD value，apoptosis aspase-3 expressions of MH7A cells in each group（

表3 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、lnc AL92±s）Tab.3 Comparison of OD value，apoptosis aspase-3 expressions of MH7A cells in each group（

Note：Compared with Mock group，1）P＜0.05；compared with si-NC group，2）P＜0.05.

Mock si-NC si-AL928768.3 FP 1.00±0.10 0.99±0.09 0.28±0.031）2）80.732 0.000 1.00±0.09 0.97±0.09 2.86±0.281）2）111.511 0.000 0.73±0.07 0.72±0.07 0.41±0.041）2）26.132 0.001 0.31±0.03 0.32±0.03 0.14±0.011）2）48.474 0.000 4.25±0.61 4.73±0.66 18.16±2.071）2）110.184 0.000 0.11±0.01 0.10±0.01 0.36±0.041）2）108.500 0.000images/BZ_27_235_2210_2240_2268.png

圖2 抑制lnc AL928768.3對MH7A細胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effect of inhibiting lnc AL928768.3 on proliferation and apoptosis of MH7A cells

2.4 干擾miR-92a-3p 逆轉了抑制lnc AL928768.3對MH7A 細胞增殖和凋亡的影響 qPCR、MTT、流式細胞術和Western blot 檢測結果顯示，與si-AL928768.3 組 和si-AL928768.3+anti-miR-NC 組 相比，si-AL928768.3+anti-miR-92a-3p 組MH7A 細 胞miR-92a-3p 表達明顯下調（P＜0.05），OD 值及l(fā)nc AL928768.3 和PCNA 表達均明顯升高（P＜0.05），細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 表達均明顯降低（P＜0.05）；si-AL928768.3組和si-AL928768.3+anti-miRNC組以上指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3、表4）。

表4 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、lnc AL928768.3、miR-92a-3p、PCNA和Cleaved Caspase-3表達比較（s）Tab.4 Comparison of OD value，apoptosis rate，lnc AL928768.3，miR-92a-3p，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

表4 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、lnc AL928768.3、miR-92a-3p、PCNA和Cleaved Caspase-3表達比較（s）Tab.4 Comparison of OD value，apoptosis rate，lnc AL928768.3，miR-92a-3p，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

Note：Compared with si-AL928768.3 group，1）P＜0.05；compared with si-AL928768.3+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

si-AL928768.3 si-AL928768.3+anti-miR-NC si-AL928768.3+anti-miR-92a-3p FP 1.00±0.11 0.96±0.09 2.42±0.221）2）90.735 0.000 1.00±0.10 1.00±0.09 0.31±0.031）2）75.174 0.000 0.42±0.04 0.41±0.04 0.70±0.071）2）34.482 0.000 0.15±0.02 0.15±0.01 0.32±0.031）2）119.786 0.000 18.32±2.21 18.19±2.07 7.01±1.131）2）36.319 0.000 0.35±0.03 0.34±0.03 0.16±0.021）2）46.773 0.000images/BZ_27_235_2868_2240_2927.png

圖3 干擾miR-92a-3p逆轉了抑制lnc AL928768.3對MH7A細胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Interference with miR-92a-3p reversed effect of inhibiting lnc AL928768.3 on proliferation and apoptosis of MH7A cells

2.5 miR-92a-3p 靶向結合ADAM10 生物信息學TargetScan在線數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，miR-92a-3p與ADAM10 3'UTR 存在靶向結合序列（圖4）。雙熒光素酶報告基因實驗結果證實，與miR-NC 組相比，miR-92a-3p 組ADAM10-Wt 細胞相對熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而ADAM10-Mut 細胞相對熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05，表5）。

表5 各組MH7A細胞相對熒光素酶活性比較（±s）Tab.5 Comparison of relative luciferase activity of MH7A cells in each group（s）

表5 各組MH7A細胞相對熒光素酶活性比較（±s）Tab.5 Comparison of relative luciferase activity of MH7A cells in each group（s）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-92a-3p tP ADAM10-Wt 1.00±0.10 0.29±0.031）11.779 0.000 ADAM10-Mut 1.00±0.09 0.94±0.09 0.817 0.460

圖4 miR-92a-3p與ADAM10 3'UTR存在互補配對序列Fig.4 Complementary pairing sequence between miR-92a-3p and ADAM10 3'UTR

2.6 lnc AL928768.3 通 過miR-92a-3p/ADAM10 軸對MH7A 細胞增殖和凋亡的影響 Western blot、MTT 和流式細胞術檢測結果顯示，與si-NC 組相比，si-ADAM10 組MH7A 細 胞ADAM10 表 達 明 顯 下 調（P＜0.05），OD 值和PCNA 表達明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3表達均明顯升高（P＜0.05）；與si-ADAM10 組相比，si-ADAM10+anti-miR-92a-3p 組 和si-ADAM10+AL928768.3 組ADAM10、PCNA表達及OD值均明顯升高（P＜0.05），細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 表達均明顯降低（P＜0.05，圖5、表6）。

圖5 lnc AL928768.3通過miR-92a-3p/ADAM10軸對MH7A細胞增殖和凋亡的影響Fig.5 Effect of lnc AL928768.3 on proliferation and apoptosis of MH7A cells through miR-92a-3p/ADAM10 axis

表6 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、ADAM10、PCNA和Cleaved Caspase-3表達比較（±s）Tab.6 Comparison of OD value，apoptosis rate，ADAM10，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

表6 各組MH7A細胞OD值、凋亡率、ADAM10、PCNA和Cleaved Caspase-3表達比較（±s）Tab.6 Comparison of OD value，apoptosis rate，ADAM10，PCNA and Cleaved Caspase-3 expressions of MH7A cells in each group（±s）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05；compared with si-ADAM10 group，2）P＜0.05.

3 討論

RA 是一種常見的慢性自身免疫性疾病，特征為關節(jié)發(fā)炎、軟骨破壞和骨侵蝕［9］。最近研究顯示，lncRNA 參與調節(jié)RA 患者SFs 增殖、凋亡和促炎細胞因子分泌［5，10］。本研究中，lnc AL928768.3 作為miR-92a-3p的ceRNA，導致ADAM10上調并促進RA進展。越來越多的研究表明，lncRNA 是人類病理學的重要調節(jié)因子，且lncRNA 在免疫系統(tǒng)中起重要作用，與自身免疫?。ò≧A）發(fā)生和發(fā)展密切相關［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，RA 滑膜組織lnc AL928768.3表達升高，與既往研究結論一致［8］。功能實驗顯示抑制lnc AL928768.3可能抑制MH7A細胞增殖并誘導細胞凋亡。RA 中SFs 激活是受累滑膜向健康滑膜轉化的關鍵因素，導致關節(jié)炎擴張和遠處關節(jié)破壞。RA-SFs增殖增強和凋亡不足可能使其擴散，導致骨破壞。RA-SFs增殖也會導致免疫應答，最終導致 關 節(jié) 損 傷［4，13］。 本 研 究 首 先 證 明 了lnc AL928768.3 在RA 滑膜組織中表達上調，表明其參與了RA 發(fā)病機制，與既往研究關于RA 患者滑膜組織中l(wèi)nc AL928768.3 表達上調一致。 但lnc AL928768.3 在RA 患者SFs 中的作用尚未闡明。本研究表明，抑制lnc AL928768.3 表達能夠在體外抑制MH7A細胞增殖，并促進其凋亡。

lncRNA 通過介導功能修飾、組蛋白修飾和染色質重塑發(fā)揮作用［16］。此外，lncRNA 通過海綿狀特異性miRNA 調節(jié)mRNA 轉錄［14-16］。研究已證實miR-92a-3p在RA患者中呈低表達；miR-92a-3p通過抑制細胞增殖、減少促炎細胞因子產(chǎn)生和誘導RA-SFs凋亡發(fā)揮保護作用［17］。本研究通過生物信息學工具和熒光素酶報告分析證實lnc AL928768.3直接結合miR-92a-3p。此外，抑制lnc AL928768.3 表達能夠上調MH7A 細胞miR-92a-3p 表達。因此，本研究假設lnc AL928768.3 通過直接調節(jié)miR-92a-3p 在RASFs 中發(fā)揮作用，結果顯示，干擾miR-92a-3p 能夠逆轉抑制lnc AL928768.3對MH7A細胞增殖抑制和凋亡的誘導作用，證實lnc AL928768.3是RA-SFs的癌基因，靶向調控miR-92a-3p。作為miR-92a-3p 的直接靶點，ADAM10 在RA 中高表達已被XIE 等［18］證實。本研究證實，抑制ADAM10 表達能夠有效抑制MH7A細胞增殖，并促進細胞凋亡，且抑制miR-92a-3p或過表達lnc AL928768.3 能夠恢復抑制ADAM10對MH7A 細胞增殖抑制和凋亡的誘導作用。由于lnc AL928768.3 可與miR-92a-3p 結合，本實驗通過Western blot 檢測ADAM10 表達，并證明lnc AL928768.3 能夠通過海綿吸附miR-92a-3p 進而上調ADAM10 表達。證實lnc AL928768.3 通過miR-92a-3p/ADAM10 軸促進RA MH7A 細胞增殖，抑制細胞凋亡，從而促進RA發(fā)生和進展。

綜上，本研究結果顯示，lnc AL928768.3通過與miR-92a-3p 結合負調控miR-92a-3p 表達，從而上調ADAM10 表達。lnc AL928768.3 能夠促進RA-SFs增殖，抑制細胞凋亡。因此，lnc AL928768.3可能是RA 患者有效的診斷和治療靶點。但本研究存在一定局限性，僅涉及體外細胞實驗，未在動物體內進行驗證尚顯不足，因此，后續(xù)將在動物體內探究lnc AL928768.3的作用和機制。