李慶妍 劉 東

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌的80%左右，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，嚴(yán)重危害人們的生命健康。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）作為Her/ErbB受體家族的一員，是一種位于細(xì)胞表面的酪氨酸激酶（TK）受體，在與配體結(jié)合后發(fā)生二聚化，從而促進(jìn)下游信號(hào)通路的激活，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。吉非替尼作為首個(gè)表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶受體抑制劑（EGFR-TKIs）靶向藥物，可用于治療轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌EGFR 19 del或外顯子21 L858R突變患者。盡管EGFR陽(yáng)性突變的NSCLC患者經(jīng)吉非替尼治療后無(wú)進(jìn)展生存期顯著延長(zhǎng)，但大部分的患者在治療后幾個(gè)月就出現(xiàn)耐藥[1]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明EGFR基因突變（如Kras突變）、二次基因突變（如T790M突變約占50%）以及旁路的激活等可能是EGFR-Tki原發(fā)/繼發(fā)性耐藥的重要機(jī)制，但具體機(jī)制仍不明確。因此探究吉非替尼耐藥機(jī)制，對(duì)于療效預(yù)測(cè)及克服腫瘤耐藥具有重要的意義。近年來(lái)，不涉及基因序列改變的表觀遺傳學(xué)機(jī)制在腫瘤耐藥中的作用日益受到關(guān)注，且成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。表觀遺傳修飾包括非編碼RNA（non-coding RNAs）調(diào)控、DNA甲基化和組蛋白修飾等，可以在不改變DNA序列的情況下調(diào)控基因表達(dá)、維持基因組穩(wěn)定性[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)異常在EGFR-TKI耐藥中發(fā)揮重要作用。因此，本文綜述了NSCLC靶向治療獲得性耐藥中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，以期為EGFR-TKIs耐藥開(kāi)發(fā)新的對(duì)策提供幫助。

1 非編碼RNA調(diào)控

非編碼RNA包括LncRNAs、miRNAs等，但對(duì)于基因調(diào)控具有多種生物學(xué)功能，并與NSCLC耐藥密切相關(guān)。

miRNAs是一種長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的小的非編碼調(diào)控RNA，在癌癥起始和進(jìn)展過(guò)程中對(duì)幾乎所有失調(diào)特征都有調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和凋亡。許多miRNAs通過(guò)靶向EGFR信號(hào)通路在癌癥治療過(guò)程中具有特定的調(diào)控作用；miR21是研究最多的關(guān)于EGFRTKIs的miRNA，在肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲過(guò)程中表達(dá)上調(diào)。miR21表達(dá)抑制了EGFR突變體NSCLC細(xì)胞中PTEN（抑癌基因）和程序性死亡4基因（PDCD4）的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFRTKI藥物敏感性下降，出現(xiàn)耐藥。它還對(duì)PI3K/AKT通路的激活有調(diào)節(jié)作用，其通過(guò)抑制PI3K/AKT通路來(lái)逆轉(zhuǎn)吉非替尼的耐藥性[3]和miR214的過(guò)表達(dá)。間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子（MET）擴(kuò)增是吉非替尼獲得性耐藥最常見(jiàn)的替代途徑，而miR130a的表達(dá)與MET呈負(fù)相關(guān)。miR130a通過(guò)與MET的3'-UTR結(jié)合抑制其表達(dá)，故miR130a過(guò)表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)吉非替尼的耐藥性[3]。而miR181a的過(guò)表達(dá)，則會(huì)導(dǎo)致其靶基因GAS7（生長(zhǎng)停滯特異蛋白7）表達(dá)下調(diào)，從而拮抗吉非替尼在耐藥細(xì)胞的敏感性[4]。除此之外，miR153的表達(dá)下調(diào)和miR214的過(guò)表達(dá)均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFRTKIs的耐藥[1]。

LncRNAs是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的線性RNA，在基因調(diào)控中發(fā)揮作用。Wang Z等[5]對(duì)63例晚期肺腺癌患者的組織標(biāo)本測(cè)定，用吉非替尼處理后發(fā)現(xiàn)獲得性耐藥組中LncRNA SNHG5顯著下調(diào)，在原發(fā)性吉非替尼耐藥組患者中沒(méi)有差異。另有研究[6]則發(fā)現(xiàn)LINC00460與EGFR表達(dá)呈正相關(guān)，miR-769-5p與EGFR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。由此推測(cè)Lnc00460的過(guò)表達(dá)和LncRNA SNHG5的表達(dá)沉默均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)吉非替尼產(chǎn)生耐藥。王守忠等[7]用不同濃度的吉非替尼處理肺癌細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)吉非替尼耐藥細(xì)胞中LncRNA GIHCG 與miR-204-5p的表達(dá)，用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證LncRNA GIHCG 與miR-204-5p的靶向關(guān)系，證明了LncRNA GIHCG通過(guò)靶向調(diào)控miR-204-5p的信號(hào)通路，使得肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼產(chǎn)生耐藥。而陳晨等[8]發(fā)現(xiàn)GAS5（生長(zhǎng)停滯特異蛋白5）的過(guò)表達(dá)與EGFR通路呈負(fù)相關(guān)，并能夠逆轉(zhuǎn)A549細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥。

因此，研究非編碼RNA可能為未來(lái)逆轉(zhuǎn)吉替尼耐藥提供一個(gè)治療靶點(diǎn)。

2 組蛋白修飾

染色質(zhì)是由DNA、組蛋白和非組蛋白組成的復(fù)合物，組蛋白是一種小的、帶正電荷的蛋白質(zhì)。H2A、H2B、H3、H4四對(duì)核心組蛋白與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，共同形成的八聚體稱為核小體。組蛋白伸出核小體外的氨基末端通過(guò)多種翻譯后修飾來(lái)改變核小體的松緊結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控基因表達(dá)[9]。組蛋白修飾包括乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化、丁基化等。這些修飾方式依賴組蛋白修飾酶作用，這些酶能夠“寫(xiě)入”“讀取”或“擦除”表觀遺傳標(biāo)記，成為潛在的治療靶點(diǎn)。

各種研究表明，靶向外蛋白質(zhì)組蛋白修飾可以改善腫瘤的耐藥性?，F(xiàn)有研究表明HDACs在癌癥中經(jīng)常過(guò)表達(dá)，并已成為潛在的治療靶點(diǎn)。BCL-2相互作用的細(xì)胞死亡介質(zhì)（BIM）是促凋亡蛋白BCL-2家族成員之一，BIM缺失會(huì)使TKIs無(wú)法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs耐藥。伏立司他（一種HDAC抑制劑）已被證明可以恢復(fù)BIM的功能，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、不可逆生長(zhǎng)抑制及凋亡，進(jìn)而恢復(fù)EGFR突變和吉非替尼耐藥的NSCLC對(duì)吉非替尼的敏感性[10]。還有研究[11]發(fā)現(xiàn)p300或CREB結(jié)合蛋白（CBP）通過(guò)組蛋白乙?；龠M(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而p300/CBP抑制劑A485與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體聯(lián)合治療對(duì)EGFR-TKIs耐藥的NSCLC，發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞數(shù)量增加，并對(duì)細(xì)胞增殖有長(zhǎng)期抑制作用。而TCN19（一種新型的EGFR和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體雙重抑制劑）則是通過(guò)泛素蛋白酶降解組蛋白，從而誘導(dǎo)耐藥的EGFR突變NSCLC細(xì)胞凋亡，克服了吉非替尼耐藥性[12]。

3 DNA甲基化

近年來(lái)，DNA甲基化是腫瘤表觀遺傳學(xué)中的研究熱點(diǎn)。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸中，其中一個(gè)甲基被添加到胞嘧啶的第5位碳原子上。在正常生理?xiàng)l件下，它是一種動(dòng)態(tài)平衡，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）和DNA去甲基化酶調(diào)控，對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控和異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要影響。研究表明，腫瘤抑癌基因CpG島啟動(dòng)子中的基因特異性高甲基化和全基因組低甲基化可能與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

DNA甲基化穩(wěn)態(tài)的破壞與NSCLC靶向治療獲得性耐藥具有相關(guān)性。原發(fā)性或獲得性耐藥的腫瘤細(xì)胞大多伴隨DNA異常甲基化，且可能是腫瘤細(xì)胞耐藥表型產(chǎn)生的重要機(jī)制。已有研究表明EGFR基因CpG島的甲基化參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。隨后國(guó)內(nèi)外研究者也對(duì)于靶向藥物（包括EGFR TKI）耐藥機(jī)制進(jìn)行了系列探索研究，發(fā)現(xiàn)基因異常的甲基化可能導(dǎo)致靶向藥物治療敏感性降低。國(guó)內(nèi)學(xué)者馮繼鋒研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)EGFR基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1650對(duì)吉非替尼獲得性耐藥的機(jī)制之一[13]。王起龍等[14]利用重亞硫酸鹽測(cè)序法（bsp）對(duì)人肺腺癌pc9/gr耐藥細(xì)胞株的EGFR基因甲基化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)吉非替尼可能通過(guò)EGFR啟動(dòng)子甲基化誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生獲得性耐藥。天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所在細(xì)胞及動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)EGFR且EGFR基因CpG島高甲基化的細(xì)胞系對(duì)吉非替尼不敏感，而后的去甲基化治療可明顯改善吉非替尼治療的敏感性[15]。在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型上得到驗(yàn)證后，開(kāi)始了一系列真實(shí)世界的探索研究。Nguyen HN等[16]在對(duì)EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥的122例患者檢測(cè)結(jié)果顯示有多個(gè)基因調(diào)控區(qū)域出現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，其中一組參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的基因是Homeobox（HOX）基因。Shu SF等[17]通過(guò)對(duì)79例服用EGFR-TKIs的晚期肺腺癌患者的全基因組DNA甲基化分析和163例EGFR突變患者的焦磷酸測(cè)序，構(gòu)建了一個(gè)DNA甲基化圖譜，其中包含216個(gè)甲基化CpG位點(diǎn)，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)HOXB9的高甲基化可能與EGFR-TKIs的耐藥有關(guān)。相關(guān)研究[10]通過(guò)對(duì)正常組織、腫瘤細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤細(xì)胞的對(duì)比發(fā)現(xiàn)EGFR的CpG島甲基化使得mRNA表達(dá)缺失，從而導(dǎo)致EGFR表達(dá)沉默，使得EGFR突變的實(shí)體腫瘤細(xì)胞系對(duì)吉非替尼耐藥。而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（DNMTIs）地西他濱聯(lián)合吉非替尼治療則可以改善腫瘤細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性，恢復(fù)靶向藥物治療的敏感性。Song H等[18]用5-AzaCdR（一種DNMTIs）處理PC9/GR（存在T790M突變的吉非替尼耐藥細(xì)胞系）后，死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK）啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)由高變低，而腫瘤細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性則由低變高。該實(shí)驗(yàn)證明了PC9/GR細(xì)胞系的DAPK基因啟動(dòng)子處于甲基化狀態(tài)，可降低DAPK基因的表達(dá)甚至缺失，下調(diào)DAPK蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致吉非替尼耐藥。

由此可見(jiàn)，多種基因的甲基化可能參與了吉非替尼耐藥，大多研究?jī)H限于細(xì)胞水平及動(dòng)物模型，對(duì)于其真實(shí)世界研究較少，并且由于檢測(cè)方法的限制，僅能判定DNA甲基化定性，對(duì)于EGFR等基因具體甲基化水平（定量）、耐藥相關(guān)的差異性甲基化CpG位點(diǎn)（定位）的檢測(cè)篩選存在困難，因此探究非小細(xì)胞肺癌患者吉非替尼耐藥后基因具體甲基化狀態(tài)及尋找耐藥相關(guān)差異性甲基化CpG位點(diǎn)至關(guān)重要。

4 總結(jié)與展望

EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，不同的機(jī)制之間也可以相互影響。在主要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制中，DNA甲基化可能是研究最多的，值得注意的是，腫瘤的表觀遺傳變化通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)模式參與了獲得性耐藥性的進(jìn)化，但仍缺少相關(guān)的表觀基因組定量數(shù)據(jù)。本課題組結(jié)合前人研究基礎(chǔ)深入研究并探討DNA甲基化相關(guān)的耐藥機(jī)制，篩選靶向治療療效預(yù)測(cè)及耐藥相關(guān)甲基化CpG位點(diǎn)，可能作為EGFR-TKI療效預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志物，同時(shí)為后續(xù)研發(fā)去甲基化藥物的治療提供精準(zhǔn)靶點(diǎn)，更好地指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)靶向用藥。由于 DNA啟動(dòng)子甲基化是一個(gè)可逆的過(guò)程，表觀遺傳干預(yù)如去甲基化藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用可能是逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥的有效治療策略。