李宇倩 高創(chuàng)創(chuàng) 李明超 李曉蕾 郝 倩

(1. 昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南 昆明 650500； 2. 昆明理工大學分析測試研究中心，云南 昆明 650500)

紫娟茶是一種芽、葉、莖均為紫色的茶樹品種，為普洱茶的一個重要變種[1]。紫娟茶具有明顯的降壓及抗敏作用[2]，且含有豐富的化學成分，如兒茶素類[3-4]、花青素類[5]、色素[6]及微量元素[7]等。前期研究[8]表明，紫娟茶中含有甲基化兒茶素類成分。甲基化兒茶素是最早被日本科學家[9]從綠茶品種Benihomare中分離得到，是具有顯著抗過敏、消炎、降血壓等效果的新型化合物[10]。Sano等[11-12]分別從臺灣凍頂烏龍、綠茶Benihomare中先后分離得到EGCG3"Me和EGCG4"Me，且EGCG3"Me在動物血液中的穩(wěn)定性顯著高于未甲基化的EGCG，其口服吸收率約為EGCG的9倍[13]，這可能是由于甲基化后的兒茶素脂溶性增加，總體脂溶量和吸收率均高于正常兒茶素，其生物利用度也有很大程度提高[14]。此外，茶樹秋冬季鮮葉中的甲基化兒茶素含量高于春夏季，且隨葉片成熟度的提高而升高[15]。呂海鵬等[16]研究表明紫娟茶第三葉的EGCG3"Me成分含量最高并達到1.24%。目前關(guān)于兒茶素提取工藝優(yōu)化的研究多以提取時間、提取溫度、溶液含水率等為影響因素，通過響應(yīng)面法對兒茶素提取工藝進行優(yōu)化[17-18]。但有關(guān)甲基化兒茶素的提取工藝研究甚少[13]。

試驗前期，從云南產(chǎn)紫娟茶中分離得到的兩個甲基化兒茶素EGCG3"Me和ECG3"Me結(jié)構(gòu)如圖1所示。試驗擬采用HPLC和響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫娟茶中甲基化兒茶素成分的提取工藝，采用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析并建立分析模型，明確提取時間、提取溫度和料液比3個因素對紫娟茶中甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)提取質(zhì)量分數(shù)的交互影響，以期為該茶樹品種開發(fā)新功能性飲料及保健食品的發(fā)展提供依據(jù)。

圖1 EGCG3"Me和ECG3"Me結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

紫娟茶：2010年，產(chǎn)地云南邦東；

EGCG3"Me、ECG3"Me標準品：純度為95%，昆明理工大學云南省高校靶點藥物篩選與利用重點實驗室自制；

無水甲醇、無水乙醇：分析純，天津致遠化學試劑有限公司；

三氟乙酸：分析純，重慶川東化學試劑廠；

乙腈：色譜純，美國BCR試劑公司；

電子天平：CP64C型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

高效液相色譜：U-3000型，戴安(中國)有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：SB-1200型，上海愛朗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準樣品制備及標準曲線繪制 參照孫業(yè)良等[13-14,19-20]的方法。HPLC條件：Welchrom C18色譜分析柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；乙腈(A)—50 mmol/L磷酸(B)為流動相，4%～100%梯度洗脫，洗脫時間60 min，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，波長280 nm。

1.2.2 精密度試驗 取混合標準品液6份，按1.2.1的HPLC條件分別進樣6次，計算EGCG3"Me和ECG3"Me峰面積的相對標準偏差(RSD)。

1.2.3 重復性試驗 選取供試品溶液6份，按1.2.1的HPLC條件連續(xù)進樣6次，計算EGCG3"Me和ECG3"Me峰面積。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗 選取供試品溶液1份，配制后避光冷藏0，2，4，6，8，12 h，按1.2.1的HPLC條件進樣，計算EGCG3"Me和ECG3"Me的RSD值。

1.2.5 回收率試驗 選取已確定濃度的含有EGCG3"Me的樣品6份，各加入0.1 mg EGCG3"Me標品，按樣品質(zhì)量分數(shù)測定方法進行處理和測定；取已確定濃度的含有ECG3"Me的樣品6份，加入0.1 mg ECG3"Me標準品，按樣品質(zhì)量分數(shù)測定方法處理和測定，計算樣品的平均加樣回收率。

1.2.6 單因素試驗

(1) 提取溶劑：準確稱取1.00 g紫娟茶樣品，浸泡于50 mL溶液中，分別以酸性甲醇(1% TFA)、酸性乙醇(1% TFA)、水、酸性水(1% TFA)、酸性甲醇水(1% TFA)、酸性乙醇水(1% TFA)為提取溶劑， 60 ℃提取60 min，重復提取3次，取上清經(jīng)微孔濾膜后進行HPLC分析，考察提取溶劑對浸提液中甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)的影響。

(2) 提取時間：精確稱取1.00 g紫娟茶樣品，浸泡于50 mL溶液中，以酸性乙醇(1% TFA)為溶劑，60 ℃下分別提取20，40，60，80，100，120 min，重復提取3次，取上清經(jīng)微孔濾膜后進行HPLC分析，考察提取時間對浸提液中甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)的影響。

(3) 提取溫度：精確稱取1.00 g紫娟茶樣品，浸泡于50 mL溶液中，以酸性乙醇(1% TFA)為溶劑，提取溫度分別為30，40，50，60，70，80 ℃，提取時間為100 min，重復提取3次，取上清液經(jīng)微孔濾膜過濾后進行HPLC分析，考察提取溫度對浸提液中甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)的影響。

(4) 料液比：精確稱取1.00 g紫娟茶樣品，以酸性乙醇(1% TFA)為溶劑，料液比分別為(m紫娟茶∶V溶劑)1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)，70 ℃提取100 min，重復提取3次，取上清液經(jīng)微孔濾膜過濾后進行HPLC分析，考察料液比對浸提液中甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)的影響。

1.2.7 響應(yīng)面試驗優(yōu)化 參照高晶晶等[21]的方法，根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定響應(yīng)面試驗的因素水平取值，采用Box-Behnken設(shè)計，以浸提液中甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)為響應(yīng)值，優(yōu)化紫娟茶中甲基化兒茶素提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫娟茶中甲基化兒茶素含量HPLC分析方法的建立

2.1.1 標準曲線制作 以不同濃度梯度ECG3"Me和EGCG3"Me兩個標品的HPLC峰面積作縱坐標，兩個標品濃度 (mg/mL) 為橫坐標，計算標準曲線線性回歸方程分別為Y=3 204.94X-36.94，Y=2 911.45X-25.65，且兩種標品在0～3 mg/mL時，質(zhì)量濃度與峰面積表現(xiàn)出顯著線性關(guān)系，其R2分別為0.999 60和0.999 86。

2.1.2 精密度試驗 經(jīng)測定，EGCG3"Me和ECG3"Me峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為1.43%，1.59%，均在2%之內(nèi)，說明試驗方法的精密度良好。

2.1.3 重復性試驗 經(jīng)測定，EGCG3"Me和ECG3"Me峰面積的RSD分別為0.49%，1.48%，均在2%之內(nèi)，說明此方法的重復性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 經(jīng)測定，EGCG3"Me和ECG3"Me峰面積的RSD值分別為0.48%，1.58%，說明供試品的溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 回收率試驗 通過回收率試驗的考察，樣品的平均加樣回收率分別為94.5%，92.5%，說明該方法有較好的回收率。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取溶劑 由圖2可知，以酸性乙醇為提取溶劑時，浸提液中EGCG3"Me質(zhì)量分數(shù)達最大值；以酸性甲醇為提取溶劑時，浸提液中ECG3"Me質(zhì)量分數(shù)達最大值。從甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)的提取質(zhì)量分數(shù)來看，酸性乙醇的提取質(zhì)量分數(shù)可達14.755 mg/g，70%酸性甲醇的次之，水溶劑提取的最小。因此試驗選取酸性乙醇作為提取溶劑。酸性乙醇中甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)提取質(zhì)量分數(shù)最高，可能是因為甲基化兒茶素比非甲基化兒茶素的脂溶性更強。

2.2.2 提取時間 由圖3可知，隨著提取時間的延長，EGCG3"Me、ECG3"Me以及甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)均先變大后減小，且均在100 min時達最大值，此時甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)為5.663 mg/g。因此選取100 min為最佳提取時間。這可能是甲基化兒茶素起初會隨時間的延長，浸出物增加，呈上升趨勢，經(jīng)過一段時間的累積，甲基化兒茶素的浸出量接近飽和，且甲基化兒茶素會隨著時間的延長存在部分降解的現(xiàn)象，從而呈下降趨勢。

圖3 提取時間對甲基化兒茶素質(zhì)量分數(shù)的影響

2.2.3 提取溫度 由圖4可知，隨著提取溫度的升高，物質(zhì)擴散系數(shù)增大，浸出量增大，EGCG3"Me、ECG3"Me以及甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)均增加，當提取溫度>60 ℃時，EGCG3"Me、ECG3"Me以及甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)上升趨勢均趨于平緩當提取溫度為60 ℃時，甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)為15.467 mg/g；當提取溫度為70 ℃時，甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)為17.177 mg/g，提取質(zhì)量分數(shù)明顯提高；當提取溫度為80 ℃時，甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)為19.605 mg/g，雖然有增長的趨勢但較平緩，且乙醇的沸點為78.5 ℃，隨著提取溫度的升高，乙醇會因沸騰而造成揮發(fā)，影響溶劑對紫娟茶的浸提作用。因此，確定最佳的提取溫度為70 ℃。

圖4 提取溫度對甲基化兒茶素質(zhì)量分數(shù)的影響

2.2.4 料液比 由圖5可知，隨著料液比的增加，EGCG3"Me、ECG3"Me以及甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)上升，且當料液比(m紫娟茶∶V溶劑)>1∶70 (g/mL)后上升趨勢較平穩(wěn)。但就甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)來看，當料液比(m紫娟茶∶V溶劑)為1∶10～1∶70 (g/mL)，甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)逐漸升高，當料液比(m紫娟茶∶V溶劑)為1∶70～1∶90 (g/mL)時，甲基化兒茶素質(zhì)量分數(shù)雖有增高但趨于平緩，考慮其經(jīng)濟效益，選擇1∶70 (g/mL)作為最優(yōu)料液比。

圖5 料液比對甲基化兒茶素質(zhì)量分數(shù)的影響

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面模型構(gòu)建 基于單因素試驗結(jié)果，選取提取時間、提取溫度和料液比為試驗因素，以浸提液中甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件輔助設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。試驗因素水平見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面因素水平

對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，經(jīng)擬合得到甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)的二次多項回歸方程為：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

(1)

表3 回歸方程的方差分析?

2.3.3 響應(yīng)面曲面分析 由圖5可知，提取時間與料液比交互作用的曲面相對較陡，因此提取溫度對用酸性乙醇提取甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)的影響顯著性最強；料液比對甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)的影響次之。在圖6(b)和圖6(d)中，隨提取時間增加兒茶素質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，提取時間在110 min左右出現(xiàn)最大值；在圖6(d)和圖6(f)中，隨著料液比增大兒茶素質(zhì)量分數(shù)先快速增加后趨于平緩；在圖6(b)和圖6(f)中，隨著提取溫度升高兒茶素質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，提取溫度在75 ℃左右出現(xiàn)最大值。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化模型可預測紫娟茶中甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)提取的最優(yōu)條件為以酸性乙醇為提取溶劑，提取時間100 min、提取溫度75 ℃、料液比(m紫娟茶∶V溶劑)1∶74 (g/mL)，此時浸提液中甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)理論值為27.1 mg/g。

圖6 各因素交互作用的等高線和響應(yīng)面圖

2.3.4 驗證實驗 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化所得最優(yōu)提取條件進行3次平行實驗，測定浸提液中EGCG3"Me質(zhì)量分數(shù)平均值為13.4 mg/g，ECG3"Me質(zhì)量分數(shù)平均值為13.3 mg/g，甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)平均值為26.7 mg/g。甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)質(zhì)量分數(shù)與理論預測值的相對誤差為1.48%，說明該回歸模型優(yōu)化的工藝組合是有效的。

3 結(jié)論

建立了紫娟茶中甲基化兒茶素含量的HPLC分析方法，并對其提取工藝進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，紫娟茶中甲基化兒茶素(EGCG3"Me和ECG3"Me)的最優(yōu)提取工藝為以酸性乙醇為提取溶劑，提取時間100 min、提取溫度75 ℃、料液比(m紫娟茶∶V溶劑)1∶74 (g/mL)，此時甲基化兒茶素質(zhì)量分數(shù)為26.7 mg/g，與理論預測值的相對誤差為1.48%。后續(xù)考慮對甲基化兒茶素的藥理作用進行研究，分析不同位點的甲基化對兒茶素的藥理作用的影響，并研究不同藥理作用形成的原因。