趙凱迪 王秋丹 林長(zhǎng)青

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，吉林 延吉 133000)

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)是菊科菊屬的多年生宿根草本植物，又名壽客、金英、延年、隱逸花。其主要活性成分為黃酮類化合物、多糖、揮發(fā)油類等，并具有抑菌、抗病毒、抗氧化、促進(jìn)膽固醇代謝等作用[1-2]。

植物多糖，又稱為植物多聚糖，一般分為中性多糖和酸性多糖?，F(xiàn)有研究已指出植物多糖具有抗氧化[3]、降血脂[4-5]、調(diào)節(jié)免疫功能[6-7]、抗腫瘤[8-9]、降血糖[5]、抑菌[3]等功效。植物多糖因其豐富的生物活性功能，現(xiàn)已被開(kāi)發(fā)為多種保健食品[10]。但目前對(duì)于菊花多糖的報(bào)道多是集中在菊花多糖的提取工藝以及純化研究[11-12]，在功能性方面報(bào)道過(guò)菊花多糖抗氧化、抗腫瘤等[13-14]。

2型糖尿病(T2DM)已成為一種全球代謝性疾病，備受人們關(guān)注。據(jù)報(bào)道[15]，2019年中國(guó)糖尿病患者有1.164億人，全球超過(guò)4億成年人受到T2DM的影響，估計(jì)2040年將有超過(guò)6.4億成年人患上T2DM。

菊花富含多種營(yíng)養(yǎng)活性成分，但對(duì)菊花多糖在治療糖尿病方面的報(bào)道較少，且都是對(duì)1型糖尿病的研究[16-17]。試驗(yàn)旨在研究菊花多糖對(duì)2型糖尿病的降血糖作用及可能機(jī)制，為開(kāi)發(fā)菊花成為新降血糖產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊花：延吉市同仁堂藥店；

雄性SD大鼠：SPF級(jí)，體重(250±20) g，長(zhǎng)春億斯試驗(yàn)動(dòng)物中心；

鹽酸二甲雙胍片：北京萬(wàn)輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司；

鏈脲佐菌素(STZ)：美國(guó)Sigma公司；

大鼠胰島素(INS)ELISA試劑盒：武漢博士德生物公司；

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平，以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)：南京建成生物工程研究所；

蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒：索萊寶公司；

核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、KELCH樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Keap1)、血紅素氧合酶(HO-1)：美國(guó)Cell Signaling Technology公司；

離心機(jī)：TDZ5-WS型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；

旋蒸冷凝器：CCA-1111-CE型，東京理化器械株式會(huì)社；

血糖儀：AG-605型，天津九安醫(yī)療電子股份有限公司；

電泳儀：Western Blot型，BIO-RAD Laboratories Inc.；

凝膠成像系統(tǒng)：BioSpectrum510型，美國(guó)UVP公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菊花多糖提取 將菊花烘干粉碎，過(guò)40目篩，參照梁艷妮等[18]的方法并稍作改動(dòng)，料液比(m菊花粉∶V水)為1∶25 (g/mL)，提取時(shí)間2 h，提取溫度90 ℃，浸提2次，合并2次提取液，用85%乙醇醇沉24 h，Sevage法除蛋白，脫色，凍干成粉，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菊花多糖含量測(cè)定 采用王彥平等[19]的方法并稍作改動(dòng)：將葡萄糖配制成不同濃度梯度，按苯酚硫酸法進(jìn)行操作，測(cè)定490 nm處不同濃度葡萄糖的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱量菊花多糖粉末3 mg，蒸餾水定容至10 mL，取1 mL，加入苯酚和濃硫酸，混合后室溫放置20 min，測(cè)定490 nm處的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菊花多糖含量。

1.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 動(dòng)物置于延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周，一次性大劑量腹腔注射STZ(30 mg/kg·BW)進(jìn)行造模，72 h 后空腹血糖值FBG高于16.7 mmol/L視為造模成功，試驗(yàn)分為空白組、模型組、菊花多糖高劑量組(400 mg/kg)、菊花多糖低劑量組(200 mg/kg)，連續(xù)灌胃8周，正常組和模型組每天灌以等量的蒸餾水。試驗(yàn)過(guò)程中，記錄大鼠攝食量、飲水量，每2周記錄所有大鼠的體重和FBG。

1.2.4 大鼠OGTT的測(cè)定 在給藥最后1周，大鼠隔夜禁食12 h，灌胃葡萄糖溶液，劑量為1 g/kg·BW，每隔30 min 測(cè)定大鼠血糖含量，共測(cè)定4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

1.2.5 大鼠INS、HOMA-IR的測(cè)定 Elisa法測(cè)定大鼠INS，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。按式(1)計(jì)算胰島素敏感性水平。

HOMA-IR=FBG×INS/22.5，

(1)

式中：

HOMA-IR——胰島素抵抗指數(shù)；

FBG——大鼠空腹血糖值，mmol/L；

INS——胰島素含量，μU/mL。

1.2.6 大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的測(cè)定 將血清取出放至室溫備用，依次按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，于510 nm 處測(cè)定各孔吸光值并進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7 大鼠SOD、GSH、CAT、MDA的測(cè)定 將肝臟用0.1 mol/L Tris-HCl制備成組織勻漿，并按照說(shuō)明書測(cè)定肝臟組織中SOD、GSH、CAT、MDA的活性。

1.2.8 Western Blot法測(cè)定相關(guān)蛋白 用RIPA強(qiáng)裂解液提取肝臟組織蛋白，并用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，用PBS進(jìn)行稀釋，將質(zhì)量濃度調(diào)整為1.5 μg/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)目標(biāo)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，電壓100 V，電泳時(shí)間120 min，電泳結(jié)束后以100 V，60 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，之后于5%的脫脂奶粉中封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯影并拍照。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所得的數(shù)據(jù)以圖表和均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。P<0.05表示有顯著性差異，P>0.05表示無(wú)顯著性差異即無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花多糖含量

圖1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=11.247x-0.007 7，R2=0.995 1。由此算出菊花多糖含量為89.67%。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 菊花多糖對(duì)T2DM大鼠體重、攝食量、飲水量的影響

T2DM大鼠的典型特征為“三多一少”，即攝食多、飲水多、尿量多、體重下降。由表1可知，模型組大鼠體重最低，顯著低于其他各組(P<0.05)，經(jīng)菊花多糖灌胃后，能夠緩解T2DM大鼠體重的下降，模型組大鼠的攝食量和飲水量顯著高于其他各組(P<0.05)，經(jīng)菊花多糖灌胃后，能夠顯著減少其攝食量和飲水量(P<0.05)。這可能由于菊花多糖對(duì)T2DM大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)生了影響，從而影響其體重、攝食量和飲水量。由此可見(jiàn)，菊花多糖能夠有效改善糖尿病大鼠三多一少的癥狀。

表1 菊花多糖對(duì)大鼠體重、攝食量、飲水量的影響?

2.3 菊花多糖對(duì)T2DM大鼠FBG及OGTT的影響

由圖2可知，經(jīng)過(guò)8周的菊花多糖灌胃后，T2DM大鼠的FBG顯著下降，與模型組有極顯著差異(P<0.01)，且菊花多糖高劑量組效果更好，與陽(yáng)性組效果相當(dāng)。OGTT試驗(yàn)測(cè)定了大鼠在灌胃葡萄糖后0，30，60，90 min時(shí)的血糖水平，由圖3可知，經(jīng)過(guò)菊花多糖灌胃后，能夠提高T2DM大鼠的糖耐量，且高劑量組糖耐量極顯著好于模型組(P<0.01)。經(jīng)菊花多糖灌胃后，可能對(duì)T2DM大鼠體內(nèi)對(duì)葡萄糖的攝取及利用起到了調(diào)節(jié)作用，從而降低了其FBG水平，提高了機(jī)體的OGTT水平。菊花多糖顯示出較好的降低T2DM大鼠FBG以及提高OGTT水平的作用。吳建中等[20]和張露等[21]指出，番石榴多糖具有顯著的降血糖效果。可見(jiàn)，植物多糖具有很好的降血糖功效。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

2.4 菊花多糖對(duì)T2DM大鼠胰島素INS及HOMA-IR的影響

胰島素水平以及胰島素抵抗指數(shù)能夠反映T2DM大鼠的患病情況。如圖4所示，與模型組相比，經(jīng)過(guò)菊花多糖灌胃后的T2DM大鼠胰島素水平得到顯著降低(P<0.05)，胰島素抵抗指數(shù)也顯著降低，且呈劑量依賴性，與陽(yáng)性組效果相當(dāng)。經(jīng)菊花多糖灌胃后T2DM大鼠體內(nèi)的INS以及HOMA-IR水平下降，可能是由于菊花多糖在T2DM大鼠體內(nèi)修復(fù)了胰島β細(xì)胞，減輕了糖尿病對(duì)胰島細(xì)胞的損傷，同時(shí)改善了機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性。菊花多糖顯示出較好的降低INS以及HOMA-IR水平的作用。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

2.5 菊花多糖對(duì)T2DM大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響

由表2可知，模型組各指標(biāo)均與正常組有顯著性差異(P<0.05)，經(jīng)菊花多糖治療后能夠顯著改善TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平(P<0.05)。這可能由于菊花多糖經(jīng)體內(nèi)吸收后參與了T2DM大鼠的脂代謝并發(fā)揮了作用。Chen等[22]的研究指出牛蒡多糖能夠改善T2DM大鼠的異常脂代謝，與試驗(yàn)結(jié)果一致。更加證實(shí)菊花多糖能夠改善T2DM大鼠異常脂代謝情況。

表2 菊花多糖對(duì)T2DM大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響?

2.6 菊花多糖對(duì)T2DM大鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影響

由圖5可知，模型組均與正常組存在顯著性差異(P<0.05)，經(jīng)菊花多糖治療后能夠顯著提高SOD、GSH、CAT水平(P<0.05)，并能顯著降低MDA水平(P<0.05)。唐潔[23]研究指出，植物多糖可通過(guò)促進(jìn)抗氧化酶的表達(dá)從而抑制機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，與試驗(yàn)結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，菊花多糖能夠改善T2DM大鼠機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

2.7 菊花多糖對(duì)T2DM大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響

如圖6所示，模型組中HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著低于正常組(P<0.05)，Keap1蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組(P<0.05)，經(jīng)菊花多糖治療后的T2DM大鼠HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著提高(P<0.05)，并顯著降低了Keap1蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。但在HO-1和Nrf2蛋白的表達(dá)水平上，低劑量組效果好于高劑量組，可能是由于高劑量組的菊花多糖在吸收過(guò)程中，在體內(nèi)各種酶的作用下發(fā)生了更多的代謝，使得其作用到靶蛋白上的有效物質(zhì)減少，從而導(dǎo)致HO-1和Nrf2蛋白的表達(dá)效果不如菊花多糖低劑量組。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，水蛭多糖能夠通過(guò)調(diào)控Nrf2/HO-1通路發(fā)揮治療糖尿病的作用。Elango等[25]介紹了Nrf2/Keap1信號(hào)通路在糖尿病中的作用，認(rèn)為該信號(hào)通路在保護(hù)細(xì)胞的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，且貫穿于糖尿病的整個(gè)發(fā)展過(guò)程。由此推測(cè)，菊花多糖能夠通過(guò)調(diào)控Nrf2/Keap1/HO-1通路起到治療T2DM的作用。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

3 結(jié)論

菊花多糖能夠在動(dòng)物水平改善T2DM大鼠胰島素抵抗的狀況，降低FBG水平，改善T2DM大鼠異常脂代謝情況和氧化應(yīng)激水平，并通過(guò)調(diào)控Nrf2/Keap1/HO-1通路起到降低T2DM大鼠血糖的作用，彌補(bǔ)了菊花多糖在T2DM上的空白。但該試驗(yàn)中僅提取了菊花粗多糖，且對(duì)大鼠只做了脂代謝基礎(chǔ)指標(biāo)的測(cè)定，以及多種氧化酶和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白，未進(jìn)一步分析其多糖組分以及其對(duì)降低T2DM大鼠的其他可能機(jī)制，后續(xù)將對(duì)菊花多糖進(jìn)行組分分離，并對(duì)其在動(dòng)物以及細(xì)胞水平進(jìn)行進(jìn)一步研究。