孫海燕 劉 笑 裴金金 郝丹青 王二楠

(1. 陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2. 陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；3. 國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心秦巴地區(qū)保鮮工作站，陜西 漢中 723000;4. 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000;5. 陜西理工大學(xué)秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點實驗室〔培育〕，陜西 漢中 723000)

天麻(GastrodiaelataBl.)為蘭科植物的干燥塊莖，又名合離草等，是中國名貴的藥用植物之一。其含有香草醇、天麻素等化學(xué)成分，具有抗驚厥、抗暈眩、降血壓、改善記憶和延緩衰老等功效[1]。2020年1月2日，國家衛(wèi)健委將天麻、黨參等9種物質(zhì)列入藥食同源物質(zhì)生產(chǎn)經(jīng)營試點中。莫莉等[2]研究發(fā)現(xiàn)，天麻塊莖中分離出的內(nèi)生菌最多，其次為花莖和莖，種子中最少。熊城[3]研究發(fā)現(xiàn)，滎經(jīng)天麻中分離出的15株內(nèi)生真菌均具有良好的抗氧化活性。余麗等[4]在昭通小草壩天麻中分離出10株內(nèi)生真菌，但未對該菌株進行鑒定和后續(xù)活性研究。

文章擬以秦巴地區(qū)紅桿鮮天麻為試材，對其內(nèi)生真菌進行分離純化和鑒定，同時對其發(fā)酵液的抗菌、抗氧化和細胞活性等特性進行系統(tǒng)研究，旨在為天麻內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物活性研究奠定基礎(chǔ)，為食品天然抑菌劑、抗氧化劑的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅桿鮮天麻：種植海拔為800～1 400 m，土壤pH值5.5～7.1，采于陜西省漢中市略陽縣。

1.2 試劑及儀器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：東京化成工業(yè)株式會社；

胰酶(0.25%)、噻唑蘭(5 mg/mL，MTT)、二甲基亞砜(DMSO)：美國Sigma公司；

改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)：含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素，美國Gibco公司；

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：陜西省資源生物重點試驗室食品發(fā)酵工程試驗室；

人胚胎腎HEK293T細胞、人肺腺癌A549細胞：中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心；

恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZWY-211B型，上海智城分析儀器制造有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-ZD型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

離心機：AvantiJ-E型，美國貝克曼庫爾特有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-250B-Z型，上海博迅實業(yè)有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏試驗設(shè)備有限公司；

酶標儀：SpectraMax 190型，美國Molecular Devices公司。

1.3 天麻內(nèi)生菌分離純化

參照鄭旭[5]的方法略修改：選取200 g左右、形態(tài)良好和無病蟲害的一級鮮天麻，用自來水沖洗干凈，25 kHz超聲波清洗5 min，用濾紙拭干表面水分。無菌環(huán)境下，用75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗2次，4%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，無菌水沖洗5次。削去天麻組織表皮，切碎，加入少量石英砂和生理鹽水研磨至天麻的內(nèi)生菌與其組織分散。漿液移至LB液體培養(yǎng)基中，(30±1) ℃培養(yǎng)3 d，采用梯度稀釋法，取50 μL于LB固體培養(yǎng)基中涂布，每次處理重復(fù)3次。待菌落在培養(yǎng)基表面生長后，分別挑取各個菌落至固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化，直至獲得菌落形態(tài)一致的單一菌落。顯微鏡下觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)一致后，即初步認定為純化菌株，編號保藏。

1.4 抗菌活性測定

參照田雙娥[6]的方法略修改：取出純化菌株，(30±1) ℃活化24 h后接種至新的培養(yǎng)液中，(30±1) ℃繼續(xù)培養(yǎng)3 d，4 ℃下、10 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm 無菌濾膜器過濾。使用直接觀察測量法，將發(fā)酵液稀釋，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整發(fā)酵液濃度約為105個/mL,備用。

選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為供試細菌。分別取上述供試細菌菌懸液0.2 mL于滅菌平板中，均勻涂布，另將直徑為6 mm的無菌濾紙片浸入內(nèi)生菌發(fā)酵液中浸泡10 min，通風(fēng)晾干，貼于含供試細菌的平板中，(30±1) ℃培養(yǎng)24 h，觀察濾紙片周圍的抑菌圈大小。

1.5 抗氧化活性測定

取出純化菌株，(30±1) ℃活化24 h后接種至新的培養(yǎng)液中，(30±1) ℃繼續(xù)培養(yǎng)3 d，4 ℃下、10 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm無菌濾膜器過濾[7]。使用直接觀察測量法，將發(fā)酵液稀釋，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整發(fā)酵液濃度約為105個/mL，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.1 DPPH自由基清除率 參照Sharma等[8]的方法并略有改動。將40 μL待測樣品與160 μL DPPH溶液混合液加入酶標板中設(shè)定為樣品組；40 μL待測樣品與160 μL 無水乙醇混合液設(shè)定為背景組；40 μL超純水與160 μL DPPH溶液混合液設(shè)定為空白組。避光靜置30 min，測定517 nm處吸光度值，每個樣品重復(fù)3次。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

p——DPPH自由基清除率，%；

OD樣品組——樣品液與DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度值；

OD背景組——樣品液與無水乙醇反應(yīng)后的吸光度值；

OD空白組——水與DPPH混合溶液的吸光度值。

1.5.2 OH自由基清除率 采用試劑盒法進行測定[9]，按式(2)計算各發(fā)酵液的OH自由基清除率。

(2)

式中：

A——OH自由基清除率，%；

OD測定組——樣品與反應(yīng)液反應(yīng)后的吸光度值；

OD對照組——標準品與反應(yīng)液反應(yīng)后的吸光度值；

OD空白組——樣品空白的吸光度值。

1.5.3 總抗氧化能力 采用試劑盒法進行測定[9-10]，按式(3)計算各發(fā)酵液的總抗氧化能力。

(3)

式中：

N——總抗氧化能力；

OD測定組——樣品與反應(yīng)液反應(yīng)后的吸光度值；

OD對照組——標準品與反應(yīng)液反應(yīng)后的吸光度值；

OD空白組——樣品空白的吸光度值；

V——反應(yīng)液總體積；

v——取樣量；

n——稀釋倍數(shù)，1 000；

1.6 抑制兩種細胞生長活性測定

參照趙滿倉等[11]的方法略有修改：采用MTT法測定天麻內(nèi)生菌發(fā)酵液的細胞活性。以人胚腎HEK293T細胞和人腺癌肺A549細胞為測試細胞株，取對數(shù)生長期的供試菌細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為5×104個/mL。向96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL供試菌細胞懸液，于5% CO2下，30 ℃培養(yǎng)24 h。吸棄孔中上清液，加入200 μL新鮮完全培養(yǎng)基后，將內(nèi)生菌發(fā)酵液分別加入到對應(yīng)試驗孔中，加入體積分別為5.0，7.5，10.0，15.0，20.0 μL。陰性對照組更換為10% FBS DMEM培養(yǎng)基。每個處理重復(fù)5次，于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24，48 h后取出，吸凈孔中培養(yǎng)基，每孔加入90 μL DMEM培養(yǎng)基和10 μL MTT，于細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。測定570 nm處吸光度值。并按式(4)計算各孔細胞生長抑制率。

(4)

式中：

M——細胞生長抑制率；

M0——標準品與反應(yīng)液反應(yīng)后吸光度值的平均值；

M1——樣品與反應(yīng)液反應(yīng)后吸光度值的平均值。

1.7 活性菌株的分子生物學(xué)鑒定

使用試劑盒法對分離出的細菌進行基因組DNA提取[12-13]。使用細菌通用引物進行PCR擴增，在1%瓊脂糖凝膠上電泳擴增產(chǎn)物，切割所需DNA目的條帶。此過程委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。將測序得到的結(jié)果用Gen Bank進行BLAST分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016、Graphpad 5.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻內(nèi)生菌的分離純化

從鮮天麻中共分離出了4株內(nèi)生細菌，編號為B1～B4，其菌落特征如圖1和表1所示。

表1 鮮天麻內(nèi)生菌菌落特征

圖1 鮮天麻內(nèi)生菌菌落形態(tài)特征

2.2 天麻內(nèi)生菌發(fā)酵液的抗菌活性

由表2可知，4株內(nèi)生菌發(fā)酵液在供試菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基中均出現(xiàn)了抑菌圈，其對2種供試菌均有一定的抑制能力。其中內(nèi)生菌B2對兩種指標菌的抑菌能力最好，兩種指標菌的抑菌圈直徑分別為14.33，26.33 mm；內(nèi)生菌B1對大腸桿菌的抑菌能力較好，抑菌圈直徑為13.33 mm。內(nèi)生菌B1、B2與內(nèi)生菌B3、B4對大腸桿菌的抑菌活性之間差異顯著(P<0.05)，4株內(nèi)生菌對金黃色葡萄球菌的抑菌活性之間差異顯著(P<0.05)。研究[14-16]發(fā)現(xiàn)，貴州野生天麻抗菌成分提取物和天麻蛋白對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌能力，其中對大腸桿菌的抑菌效果最好，與試驗結(jié)果一致。此外，天麻多糖GeB40和GeB80對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有強的抑制能力[17]。

表2 天麻內(nèi)生菌發(fā)酵液的抗菌活性?

2.3 天麻內(nèi)生菌發(fā)酵液的抗氧化活性

由圖2可知，內(nèi)生菌B1對DPPH自由基的清除能力最強為69.13%，其次為內(nèi)生菌B4和內(nèi)生菌B2。4株天麻內(nèi)生菌對OH自由基清除率均較低，其中清除率最高的內(nèi)生菌B4的清除率為17.88%。內(nèi)生菌B2的總抗氧化能力最強為19.26 U/mL，其次為內(nèi)生菌B4和內(nèi)生菌B1的。內(nèi)生菌B4的總抗氧化能力與內(nèi)生菌B2、B3之間差異顯著(P<0.05)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

綜上，4株菌對兩株供試菌均有不同程度的抑制能力，與陳琛等[18-19]的研究結(jié)果基本一致。內(nèi)生菌B1、B2和B4均具有良好的抗氧化活性，其代謝產(chǎn)物中的活性物質(zhì)是否與總黃酮、總酚含量高度呈正相關(guān)還需進一步研究。

2.4 天麻內(nèi)生菌發(fā)酵液抑制兩種細胞生長活性

2.4.1 對A549細胞的生長抑制作用 由圖3可知，樣品處理48 h時，內(nèi)生菌B1隨著樣品體積的增加，抑制能力不斷增強，當樣品體積為15 μL時，內(nèi)生菌B1的能力最強為8.34%。樣品處理24，48 h時，內(nèi)生菌B2均有一定的抑制能力，抑制率最高為6.27%。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4.2 對HEK293T細胞的生長抑制作用 由圖4可知，樣品處理24，48 h時，內(nèi)生菌B2、B3和B4對人胚腎HEK293T細胞均有抑制能力且隨樣品體積的增加而增強。樣品處理24 h時，其對人胚腎HEK293T細胞抑制能力依次為B3>B4>B2；樣品處理48 h時，其對人胚腎HEK293T細胞抑制能力依次為B2>B4>B3。其中內(nèi)生菌B2在樣品體積為20 μL，處理24 h時，抑制能力最佳為40.40%。不同樣品體積的內(nèi)生菌B4對HEK293T細胞的抑制率差異顯著(P<0.05)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.5 活性菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用16S rDNA法對4株天麻內(nèi)生菌進行分子生物學(xué)鑒定提取，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，內(nèi)生菌B1、B3和B4在700～800 bp附近出現(xiàn)較強的條帶，內(nèi)生菌B2在1 000～1 200 bp附近出現(xiàn)較強的條帶，條帶清晰，可用于測序使用。

圖5 天麻內(nèi)生菌16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

由表3可知，內(nèi)生菌B1、B2屬貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，內(nèi)生菌B3屬Lelliottiasp.，內(nèi)生菌B4屬水生拉恩菌(Rahnellaaquatilis)。目前，已有學(xué)者[2-4]從陜西、云南、四川和貴州天麻中分離出內(nèi)生真菌，其中在百宜、漢中、滎經(jīng)和昭通小草壩天麻中分別分離出16，9，15，10株內(nèi)生真菌。

表3 天麻內(nèi)生菌同源性比較

3 結(jié)論

從秦巴地區(qū)天麻中分離得到4株內(nèi)生菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA序列同源性分析，內(nèi)生菌B1和B2被鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，內(nèi)生菌B3被鑒定屬Lelliottiasp.，內(nèi)生菌B4被鑒定為水生拉恩菌。抗菌試驗表明，4株菌對兩株供試菌均具有不同程度的抑制能力，其中內(nèi)生菌B2對兩種供試菌都有強的抑制能力，內(nèi)生菌B1對大腸桿菌有較強的抑制能力?？寡趸囼灡砻鳎?株菌均具有良好的抗氧化活性。細胞活性試驗表明，內(nèi)生菌B2、B3、B4對人胚胎腎HEK293T細胞有不同程度的抑制能力，其中內(nèi)生菌B2的抑制率最高。綜上，內(nèi)生菌B2在各方面都表現(xiàn)出了良好的活性。后續(xù)可探討分離菌株的活性物質(zhì)成分及作用機理。