孫熙浛 崔承弼, 齊仕博 齊 欣

(1. 延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學藥學院，吉林 延吉 133002)

泡菜又名發(fā)酵蔬菜、腌漬菜，是將新鮮蔬菜經(jīng)低濃度鹽水或少量鹽腌漬而成，其優(yōu)勢益生菌群主要以乳酸菌為主[1-2]。高鹽飲食是導致死亡的危險元素[3]，因此，減少鹽分攝入是維護身體預防慢性病的重要手段。

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌的統(tǒng)稱[4]。泡菜發(fā)酵期間，微生物菌群不斷更替，乳酸菌會伴隨原輔料、鹽濃度和發(fā)酵條件等因素的變化而不同。只有耐受低pH、酸性強的環(huán)境且數(shù)量多、活力強的乳酸菌才能在腸道中發(fā)揮生物功效，進而在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用[5]。趙山山等[6]從貴州遵義市自制泡菜中篩選得到11株產(chǎn)酸量較高、耐酸性能優(yōu)良的乳酸菌，具有潛在的益生特性。馮金曉等[7]從6個泡菜樣品中，篩選得到2株耐酸性較強的乳酸菌。此外，乳酸菌還能夠保護腸道健康，提高絨毛密度[8]。

研究擬選取四川、河北和東北地區(qū)的低鹽泡菜，篩選出耐酸性優(yōu)良的菌株，進行形態(tài)學、生理生化鑒定及16S rDNA 分子種屬鑒定并將其命名，測定菌株的生長曲線、耐酸產(chǎn)酸能力、耐受胃腸液能力、耐膽鹽能力、疏水及自凝集能力，通過綜合比對，篩選出具有益生特性的耐酸性乳酸菌菌株，為益生菌制劑的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

14份泡菜樣品：分別為蘿卜泡菜、洋姜泡菜、白菜泡菜、紅椒泡菜、東北酸菜，來自于四川、河北和東北地區(qū)，市售；

MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術有限公司；

胃蛋白酶：北京奧博星生物技術有限責任公司；

胰蛋白酶：MYM Biological Technology Company, USA；

牛膽鹽：廣東環(huán)凱威微生物科技有限公司；

碳酸鈣、丙三醇、氯化鈉：分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；

革蘭氏試劑盒：青島青藥生物工程有限公司。

1.1.2 儀器與設備

臺式離心機：TGL-16M型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

分析天平：PWC124型，上海民橋精密科學儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌：BXM-30R型，重慶雅馬拓科技有限公司；

雷磁pH計： PHS-25型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱： YM-666型，上海新苗醫(yī)療設備有限公司；

多功能熒光酶標儀：SP-Max 3500FL型，上海閃譜生物科技有限公司；

顯微鏡：GX53型，德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 泡菜鹽度及pH值的測定

(1) 鹽度：參照彭易濤[9]的方法。

(2) pH值：按:GB 5009.237—2016執(zhí)行。

1.2.2 菌株的分離與純化 選取含鹽量≤6%的泡菜，用生理鹽水按倍比稀釋法，將菌液涂布至2% CaCO3-MRS瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，根據(jù)呈現(xiàn)的形態(tài)特征挑選菌落，反復進行平板劃線分離與純化，直至出現(xiàn)純菌落。

1.2.3 耐酸性菌株的篩選與初步鑒定 在pH 4.0的MRS液體培養(yǎng)基中接種2%的供試菌懸液，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，選取產(chǎn)生菌體沉淀生長狀況良好的菌株放入pH 3.0，2.0的液體培養(yǎng)基中進行重復篩選。將生長較為旺盛的菌株通過梯度稀釋后涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形狀、大小、顏色等特征并進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗。

1.2.4 16S rDNA分子鑒定 將分離純化的菌株送檢至生工生物工程(上海)股份有限公司，采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取鑒定菌株基因組DNA，得到16S rDNA基因組片段序列后，進行BLAST序列比對。將獲得的基因組DNA進行核酸電泳驗證，加入通用引物進行PCR擴增，正向引物為27f：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；反向引物為1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR擴增產(chǎn)物測序、雙向拼接后，用BLAST模塊在NCBI上對比同源性，使用Megalign程序繪制系統(tǒng)發(fā)育樹并進行分析。

1.2.5 耐酸性菌株的生物學性質(zhì)測定

(1) 生長曲線：在MRS液體培養(yǎng)基中按2%接種待測菌株，37 ℃靜置培養(yǎng)，隔2 h取樣，共培養(yǎng)24 h，用空白培養(yǎng)基作為對照組，測定OD600 nm值，繪制5株菌株的生長曲線。

(2) 酸耐受能力：在10 mL pH值分別為4.0，3.0，2.0的MRS肉湯培養(yǎng)基中，以2%接種量接入待測菌株，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)，測定0，24 h的OD600 nm值，用空白培養(yǎng)基作對照，按式(1)計算相對生長率。

(1)

式中：

R——相對生長率，%；

a——培養(yǎng)24 h后菌株在pH 6.3培養(yǎng)基中的OD600 nm值；

b——培養(yǎng)0 h后菌株在pH 6.3培養(yǎng)基中的OD600 nm值；

c——培養(yǎng)24 h后菌株在不同pH培養(yǎng)基中的OD600 nm值；

d——培養(yǎng)0 h后菌株在不同pH培養(yǎng)基中的OD600 nm值。

(3) 產(chǎn)酸活力：將菌株以2%的接種量接至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，向10 mL菌液中滴加酚酞指示劑，以0.1 mol/L的NaOH溶液進行滴定，直至出現(xiàn)微紅色，靜止30 s，觀察有無褪色現(xiàn)象，記錄消耗NaOH的體積[10]。產(chǎn)酸活力以每1×107個細胞，發(fā)酵1 mL MRS肉湯培養(yǎng)基得到1 μg乳酸為1個活力單位(U)。

1.2.6 耐酸性菌株的體外益生特性測定

(1) 模擬胃液耐受能力：取待測菌液，4 ℃、7 000 r/min離心8 min，用1×PBS緩沖液洗滌后懸浮菌體。取供試菌懸液各1 mL分別接種于9 mL pH值分別為4.0，3.0，2.0的人工胃液中，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，測其活菌數(shù)，按式(2) 計算存活率[11]。

(2)

式中：

S——菌株存活率，%；

N0——菌株初始的活菌數(shù)，CFU/mL；

N1——菌株處理后的活菌數(shù)，CFU/mL。

(2) 模擬腸液耐受能力：取1 mL經(jīng)人工胃液消化3 h 的菌液，接種至9 mL pH值為8.0的人工模擬腸液中，恒溫水浴培養(yǎng)8 h，測其活菌數(shù)，按式(2)計算存活率。

(3) 模擬膽鹽耐受能力：取2%培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期的菌液，接種至含0.3%膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基中，120 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)0，2，4，6，8 h，設置未添加膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基作為空白對照組，測定OD600 nm值，按式(3)計算菌株存活率[12]。

(3)

式中：

S——菌株存活率，%；

A0——不含膽鹽培養(yǎng)基的OD600 nm值；

A1——含膽鹽培養(yǎng)基的OD600 nm值。

(4) 疏水能力：取待測菌液，4 ℃、7 000 r/min離心8 min，收集菌泥，用1×PBS緩沖液洗滌，使菌體OD600 nm值為0.25±0.05，向試管中加入2 mL菌懸液、二甲苯并充分振蕩，渦旋振蕩2 min，于通風櫥靜置待其分層，分別測水相OD600 nm值，以不添加二甲苯的菌液作為空白對照組，按式(4)計算菌株的疏水率[13]。

(4)

式中：

H——疏水率，%；

A0——二甲苯混合前菌液的OD600 nm值；

A——二甲苯混合后菌液的OD600 nm值。

(5) 自凝集能力：取待測菌液，4 ℃、4 000 r/min離心8 min，收集菌泥，用1×PBS緩沖液洗滌，使其菌體OD600 nm值為0.25±0.05，37 ℃靜止后吸取上清液，設置1×PBS緩沖液作為空白對照組，測定時間分別為0，2，4，6，8，12，16，24 h，測定OD600 nm值，按式(5)計算菌株的自凝集率[13]。

(5)

式中：

A——自凝集率，%；

A0——0 h的OD600 nm值；

At——t時刻的OD600 nm值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 所有試驗重復3次，以平均值±標準差表示，利用Origin 8.5軟件作圖，運用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 理化指標檢測

由表1可知，14份樣品的含鹽量為0.87%～9.48%，符合行業(yè)標準。陳功[14]研究表明，按鹽度不同可將泡菜分為超低鹽泡菜(食鹽量≤3%)、低鹽泡菜(食鹽量≤6%)和中鹽泡菜(食鹽量≤10%)。因此，A、D是中鹽泡菜，B是低鹽泡菜，其他均為超低鹽泡菜，是因為不同地區(qū)泡菜的原材料和制作方式不同。泡菜的pH值為2.80～5.31，其鹽度和pH值無相關性。

表1 泡菜樣品的理化指標

2.2 耐酸性菌株的篩選

由表2可知，從含鹽量≤6%的12份泡菜樣品中共分離得到126株產(chǎn)生溶鈣圈的菌株，將其接種至pH 4.0的培養(yǎng)基中進行初次耐酸性篩選，結果見表3，共有35株菌生長，其中18株生長情況良好；將18株優(yōu)良菌株于pH 3.0的培養(yǎng)基中進行第2次耐酸性篩選，仍有13株菌株生長性能良好；于pH 2.0的培養(yǎng)基中進行第3次篩選，只有5株菌株生長情況良好。因此，選擇J2、N6、F8、M1、M12 5株菌株進行后續(xù)試驗。

表2 樣品中菌株的分離結果

表3 耐酸性菌株的篩選?

2.3 耐酸性乳酸菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學鑒定及生理生化鑒定 由圖1可知，菌株J2為圓形的白色不透明菌落，菌落光滑濕潤、邊緣整齊；菌株N6為乳白色的光滑菌落，中央凸起、邊緣整齊；菌株F8為圓形的乳白色菌落，表面光滑、中央凸起；菌株M1為圓形的乳白色黏稠菌落，表面濕潤；菌株M12為白色不透明菌落，表面呈黏稠光滑的圓形。5株菌株的菌落形態(tài)相似，具有乳酸菌的典型特征。

圖1 菌落形態(tài)對比圖

由圖2可知，菌株J2菌體細胞呈卵圓形或球形，成對、單個或鏈狀排列；菌株N6菌體細胞呈桿狀排列；菌株F8為短桿菌，呈單個或兩個生長，無芽孢產(chǎn)生；菌株M1為短桿菌，短鏈或呈鏈排列；菌株M12為不規(guī)則短棒狀細胞，呈短鏈狀或成對存在。5株菌株的革蘭氏染色均為藍紫色，屬于革蘭氏陽性菌。經(jīng)過氧化氫酶接觸后，5株菌株均不產(chǎn)生氣泡，為過氧化氫酶陰性菌。

圖2 顯微鏡下的細胞形態(tài)對比圖

2.3.2 16S rDNA序列同源性對比 由圖3可知，擴增產(chǎn)物條帶序列大小為1 483～1 507 bp，條帶清晰可見且無雜帶。由圖4可知，菌株J2和腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的同源性為100%，菌株N6和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)的同源性為100%，菌株M1、M12和食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)的同源性為100%，菌株F8和類植物乳桿菌(Lactobacillusparaplantarum)的同源性為100%。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物

圖4 5株菌株的16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹

王璐等[15]從果蔬發(fā)酵樣品中篩選出2株耐酸性乳酸菌，分別為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)S3-10和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)R10；李欣等[16]從黑龍江大慶地區(qū)的自然發(fā)酵酸菜中篩選出6株耐酸性乳酸菌，包括3株彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)，2株清酒乳桿菌(Lactobacillussake)，1株植物乳桿菌。這與試驗結果存在差異，可能由于不同地區(qū)的泡菜有不同的微生物菌群和生物學特性，泡菜的加工工藝及貯藏環(huán)境也會導致乳酸菌種類和數(shù)量不同，但試驗分離出了泡菜中較為少見的W.cibaria。

2.4 耐酸性乳酸菌的生物學性質(zhì)

2.4.1 生長曲線 由圖5可知，L.mesenteroidesJ2、L.paracaseiN6、L.paraplantarumF8、W.cibariaM1和W.cibariaM12均在6 h后進入對數(shù)期，16 h后進入穩(wěn)定期。楊英歌等[17]研究的乳酸菌4 h后進入對數(shù)期，14 h后進入穩(wěn)定期，而夏勒合特·巴克爾拜等[18]研究的植物乳桿菌進入對數(shù)期和穩(wěn)定期的時間分別為2，18 h。說明不同種類的乳酸菌進入對數(shù)期和穩(wěn)定期的時間不同。6 h時，L.paracaseiN6的生長速度最快，OD600 nm值為0.81；16 h時，W.cibariaM12的吸光度最高為2.41；24 h時，W.cibariaM12的吸光度最高為2.42。5株菌株生長曲線排序為W.cibariaM12>W.cibariaM1>L.paracaseiN6>L.paraplantarumF8>L.mesenteroidesJ2。

圖5 菌株的生長曲線

2.4.2 酸耐受能力和產(chǎn)酸能力 由圖6可知，L.paracaseiN6在pH為4.0，3.0，2.0時的相對生長率分別為84.23%，58.95%，20.72%，均顯著高于其他菌株(P<0.05)，W.cibariaM1和W.cibariaM12的次之。5株菌株的相對生長率排序為L.paracaseiN6>W.cibariaM1>W.cibariaM12>L.paraplantarumF8>L.mesenteroidesJ2。菌株之間的酸耐受性差異明顯，且同一菌種的不同菌株之間的酸耐受性也存在差異。

由圖6可知，L.paracaseiN6的產(chǎn)酸活力為(5.05±0.09) U，高于其他菌株；W.cibariaM12的產(chǎn)酸活力為(5.03±0.01) U，顯著高于W.cibariaM1、L.paraplantarumF8和L.mesenteroidesJ2的(P<0.05)。羅強等[19-20]研究表明，菌株耐酸產(chǎn)酸能力的相關性有待進一步研究。樣品發(fā)酵過程中產(chǎn)酸量與乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)乳酸的量呈正相關，對雜菌具有較好的抑制作用。

字母不同表示差異顯著( P<0.05)

2.5 耐酸性乳酸菌的體外益生特性

2.5.1 體外模擬胃液、腸液耐受能力 由圖7(a)可知，當pH為4.0時，5株菌存活率均在81%以上；當pH為3.0時，L.paracaseiN6的存活率為90.49%，顯著高于其他菌株(P<0.05)，W.cibariaM1和W.cibariaM12的存活率分別為72.80%，70.25%，均顯著高于L.paraplantarumF8和L.mesenteroidesJ2(P<0.05)；當pH為2.0時，L.paracaseiN6仍能達到48.65%的存活率，且存活率顯著高于其他菌株(P<0.05)，L.paraplantarumF8和L.mesenteroidesJ2均不耐受pH 2.0的強酸環(huán)境。熊強等[21]從自制泡菜中分離出的6株植物乳桿菌中，其中有4株在人工胃液中的存活率在80%以上。趙芳等[22]研究顯示，菌株在pH 2.0的人工胃液中處理2 h后幾乎都無法存活。

字母不同表示差異顯著( P<0.05)

由圖7(b)可知，經(jīng)pH 4.0胃液和pH 8.0腸液消化后菌株的存活狀況良好，存活率>62.44%；經(jīng)pH 3.0胃液和pH 8.0腸液消化后，L.paracaseiN6存活率為79.26%，顯著高于其他菌株(P<0.05)，W.cibariaM1和W.cibariaM12的存活率分別為50.65%，53.37%，差距相對較小，說明同種乳酸菌的益生特性差異不大；經(jīng)pH 2.0胃液和pH 8.0腸液消化后，L.paraplantarumF8和L.mesenteroidesJ2的存活率幾乎為零。綜上，L.paracaseiN6、W.cibariaM1和W.cibariaM12對人工胃液、腸液環(huán)境均具有較強的耐受性。

2.5.2 體外模擬膽鹽耐受能力 由圖8可知，當培養(yǎng)時間為2 h時，菌株存活率均在80%以上，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌株存活率呈下降趨勢；當培養(yǎng)時間為4 h時，L.paracaseiN6存活率為63.64%，顯著高于其他菌株(P<0.05)，與李洋等[12，23]的結果一致；當培養(yǎng)時間為8 h時，L.paracaseiN6的存活能力最強，存活率為41.16%，顯著高于其他菌株(P<0.05)，W.cibariaM12和W.cibariaM1的次之。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.5.3 疏水能力 由圖9可知，L.paracaseiN6、W.cibariaM12、W.cibariaM1和L.paraplantarumF8均屬于高度疏水菌株，疏水率均在60%以上，其中L.paracaseiN6的疏水率達78.72%，顯著高于其他菌株(P<0.05)；L.mesenteroidesJ2為中度疏水菌株，疏水率為42.81%。5株菌株的表面疏水能力為L.paracaseiN6>W.cibariaM12>W.cibariaM1>L.paraplantarumF8>L.mesenteroidesJ2。

字母不同差異顯著( P<0.05)

2.5.4 自凝集能力 由圖10可知，5株菌株的自聚集率均呈上升趨勢，與Abushelaibi等[24-25]的研究結果相似。培養(yǎng)24 h時，L.paracaseiN6的自凝集能力最高，達76.51%，與Mih等[26]的結果一致；W.cibariaM12、W.cibariaM1、L.paraplantarumF8和L.mesenteroidesJ2的自凝集率分別為65.00%，62.54%，49.95%，36.31%。

圖10 乳酸菌菌株細胞的表面自凝集率

3 結論

從14份泡菜樣品中篩選出含鹽量≤6%的12份樣品，共分離純化出126株產(chǎn)生溶鈣圈的菌株，并篩選出5株耐酸性菌株，經(jīng)16S rDNA分子鑒定為腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)J2、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)N6、類植物乳桿菌(Lactobacilluparaplantarum)F8、食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)M1和食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)M12。其中，L.paracaseiN6、W.cibariaM1和W.cibariaM12是具有益生特性的耐酸性乳酸菌菌株，可用于初步篩選，但還需進一步的穩(wěn)定性試驗和遺傳穩(wěn)定性研究，以鑒定適合人類或動物使用的潛在益生菌。