黃 璟 梁麗婷 OMEDI Jacob Ojobi 陳 誠 郭睿珺 黃衛(wèi)寧 曾永青 李 寧 高鐵成 周立源

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 深圳市金谷園實業(yè)發(fā)展有限公司，廣東 深圳 518000；3. 廣州市食品工業(yè)研究所，廣東 廣州 510663；4. 廣州焙樂道食品有限公司，廣東 廣州 511400；5. 山東稻香村食品工業(yè)有限公司，山東 菏澤 274000)

獼猴桃富含碳水化合物、膳食纖維、氨基酸、有機酸等，營養(yǎng)豐富，極具開發(fā)潛力。將獼猴桃及其副產(chǎn)物添加到面包體系中不僅可以增強面包營養(yǎng)和種類[1-2]，還可以使面包中的多酚和膳食纖維等成分得到強化[3-4]。

Zhao等[5]將獼猴桃接種釀酒酵母以提升產(chǎn)品的風(fēng)味物質(zhì)，但其并未充分發(fā)揮獼猴桃本身風(fēng)味，這是因為獼猴桃大多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)(醇類、酯類和萜烯類)以不揮發(fā)的糖苷形式存在，而這些風(fēng)味物質(zhì)多數(shù)閾值較低，對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。β-葡萄糖苷酶作為水解糖苷類香氣前體的關(guān)鍵酶類，常被作為風(fēng)味酶用于果汁和果酒的增香。彭帥等[6]發(fā)現(xiàn)利用產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株可以提升葡萄酒風(fēng)味。但產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物大多為曲霉[7]、芽孢桿菌[8]和木霉[9]等，因此難以直接用于水果發(fā)酵。錢超等[10-11]從酒曲等中國傳統(tǒng)發(fā)酵資源中分離出高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌，并將其作為發(fā)酵劑制作含葡萄汁的酸面團，面包中風(fēng)味物質(zhì)含量和種類得到了有效提升。但是其在獼猴桃及新型綠色健康烘焙食品中的研究尚未見報道。

文章擬以課題組前期分離自酒鬼酒曲的戊糖片球菌J8[10-13]為研究對象，研究乳酸菌發(fā)酵對獼猴桃理化特性及風(fēng)味的影響，并將發(fā)酵獼猴桃引入到面包體系中，分析面包面團理化性質(zhì)，評估其對獼猴桃面包烘焙和風(fēng)味特性的影響，以期為工業(yè)化開發(fā)風(fēng)味獨特、烘焙品質(zhì)優(yōu)良的水果面包提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃：海沃德品種，產(chǎn)自陜西周至；

高筋粉：河北參花面粉有限公司；

酵母：樂斯福(明光)有限公司；

MRS肉湯培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司；

戊糖片球菌(PediococcuspentosaceusKID7)J8：產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，篩選自酒鬼酒曲；

對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、庚酸甲酯、三氯乙酸：分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

蘋果酸、檸檬酸、乳酸、奎寧酸和乙酸：分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

切片機：SM-302型，新麥機械(無錫)有限公司；

pH計：FE20型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：SPX-150C型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：TSQ Quantum XLS型，美國賽默飛世爾科技公司；

電子舌：SA402B型，美國Isenso 公司；

質(zhì)構(gòu)儀：CT3型，美國Brookfield公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵獼猴桃的制備 將戊糖片球菌J8于37 ℃的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，8 000×g離心15 min，收集細(xì)胞，在滅菌生理鹽水溶液中洗滌兩次(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%)，用作發(fā)酵劑發(fā)酵獼猴桃(K-J8)，初始接種量為108CFU/mL。使用攪拌機將獼猴桃(可溶性固形物含量17.33 °Brix)攪拌成果泥，稱取100 g于121 ℃滅菌10 min，室溫冷卻10 min。將發(fā)酵劑接種至滅菌獼猴桃(WK)，27.5 ℃、180 r/min下培養(yǎng)15.5 h。

1.3.2 發(fā)酵過程中pH、TTA和菌落數(shù)測定 參照鄒奇波等[14]的方法。

1.3.3 發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶酶活測定 參照錢超等[10]的方法。

1.3.4 發(fā)酵過程中有機酸含量測定 取5 g樣品于20 mL KH2PO4溶液(0.01 mol/L)中，均質(zhì)5 min，4 ℃、5 000×g 離心10 min，上清液過0.22 μm膜，將20 μL樣品通過HPLC測定有機酸含量(乳酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸和奎尼酸)。色譜條件：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm)，流動相為10 mmol/L KH2PO4，pH 2.6，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，波長215 nm。

1.3.5 發(fā)酵過程中風(fēng)味化合物含量測定 稱取5.0 mL樣品于20 mL樣品瓶。將樣品瓶插入SPME萃取頭(50/30 μm CAR/PDMS/DVB)，50 ℃萃取30 min。250 ℃ 熱解吸3 min，進行GC-TOF/MS分析。色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為N2，流速1 mL/min。升溫程序：40 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至250 ℃，恒溫6 min。進樣、界面和離子源溫度分別為250，250，200 ℃。電子撞擊能量70 eV。

1.3.6 獼猴桃面包的制作 小麥面包(XB)、未發(fā)酵獼猴桃面包(WKB)和發(fā)酵獼猴桃面包KB-J8配方見表1。制作流程：將原料(除黃油外)倒入攪拌缸，慢攪3 min，快攪1 min；加入黃油后慢攪3 min，快攪2 min。攪拌后滾圓并松弛5 min，分割成90 g，松弛10 min，整形，置于模具，醒發(fā)90 min(38 ℃，85%)，放入烤箱(上火170 ℃，下火210 ℃)烘烤21 min。

表1 面包配方

1.3.7 面團的α-淀粉酶和蛋白酶酶活測定

(1)α-淀粉酶：參照Wang等[15]的方法。

(2) 蛋白酶：參照Thiele等[16]的方法。

1.3.8 面包烘焙特性測定

(1) 比容和硬度：參照吳玉新等[17]的方法。

(2) 膳食纖維含量：參照曹偉超等[18]的方法。

(3) 色澤：參照Sharma等[19]的方法。

1.3.9 面包游離氨基酸含量測定 參照劉若詩等[20]的方法。

1.3.10 電子舌分析 參照武盟等[21]的方法。

1.3.11 面包風(fēng)味化合物含量測定 參照張薇等[22]的方法。

1.3.12 面包感官評定 采用9分嗜好法[22]。由20位經(jīng)過培訓(xùn)的人員(男女各一半)對面包外觀、色澤、組織結(jié)構(gòu)、口感、風(fēng)味以及整體可接受度進行評分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2015、Origin 9.5以及SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃發(fā)酵過程中pH、TTA和菌落數(shù)變化

由表2可知，獼猴桃發(fā)酵15.5 h后，K-J8菌落數(shù)達(dá)108CFU/mL，表明戊糖片球菌J8在獼猴桃基質(zhì)中適應(yīng)性良好。與其他乳酸菌發(fā)酵體系相比，其菌落數(shù)比發(fā)酵火龍果體系高1～2個數(shù)量級[23]。獼猴桃pH值顯著降低，TTA值顯著增加(P<0.05)，表明戊糖片球菌J8發(fā)酵獼猴桃過程中產(chǎn)生了有機酸，如乳酸和乙酸等，而這些化合物能夠促進風(fēng)味物質(zhì)形成[24]。

表2 獼猴桃發(fā)酵前后的菌落數(shù)、pH和TTA?

2.2 獼猴桃發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶酶活變化

由圖1可知，發(fā)酵初期，β-葡萄糖苷酶酶活逐漸增加，6 h后酶活最高，達(dá)61.14 U/L，9 h后小幅下降，隨后趨于平緩直至發(fā)酵完成，其最終酶活為55.13 U/L，這與菌株的生長特性、對水果基質(zhì)適應(yīng)能力以及水果基質(zhì)中代謝物相關(guān)[25]。較高的β-葡萄糖苷酶酶活有利于釋放獼猴桃糖苷風(fēng)味前體物質(zhì)。

圖1 獼猴桃發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶酶活變化

2.3 獼猴桃發(fā)酵過程中有機酸含量變化

由表3可知，發(fā)酵后奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸含量均顯著降低(P<0.05)，分別降低了11.62%，20.26%，57.07%(P<0.05)，其中蘋果酸含量降幅最大。乳酸菌通過蘋果乳酸發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，也可以代謝檸檬酸產(chǎn)生乳酸、丙酮酸和乙酸。因此發(fā)酵后乳酸和乙酸含量顯著增加(P<0.05)，與Wei等[26]的結(jié)果相吻合。乳酸是乳酸菌的主要關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，能賦予發(fā)酵食品愉悅感受[27]；乙酸是乙酸乙酯的前體，本身帶有愉悅醋香味[28]。

表3 發(fā)酵獼猴桃的有機酸含量變化?

2.4 發(fā)酵獼猴桃的風(fēng)味化合物變化

由表4和表5可知，2種樣品中共檢出110種風(fēng)味物質(zhì)，與WK相比，K-J8的種類和含量分別增加了39.39%，94.90%。乳酸菌發(fā)酵后，酸類、酯類、醇類和萜烯類化合物含量增加，尤其是醇類和酯類，醛類和酮類化合物含量降低。WK和K-J8中共有化合物48種，主要以醇類、醛類和酮類居多，包括乙醇、己醛和乙酸乙酯等。戊糖片球菌發(fā)酵后增添了44種風(fēng)味物質(zhì)，以醇類和酯類為主，這與菌株發(fā)酵產(chǎn)生的特殊風(fēng)味物質(zhì)和β-葡萄糖苷酶水解糖苷產(chǎn)生的不同風(fēng)味物質(zhì)前體有關(guān)。

表4 發(fā)酵獼猴桃風(fēng)味化合物含量的影響

續(xù)表4

表5 獼猴桃不同揮發(fā)性風(fēng)味化合物統(tǒng)計

醇類是乳酸菌發(fā)酵過程中重要的揮發(fā)性香氣[29]，12種醇類在乳酸菌發(fā)酵后含量增加，如芳樟醇(鈴蘭香)和α-松油醇(百合、紫丁香)，這些化合物以糖苷形式結(jié)合在獼猴桃中[30]，閾值較低，對產(chǎn)品風(fēng)味具有積極影響。酯類提供水果宜人的花果香，其閾值一般較低。發(fā)酵獼猴桃中增加的酯類多為乙酸酯(乙酸甲酯和乙酸乙酯等)，是因為獼猴桃中氨基酸或碳水化合物降解產(chǎn)生的高級醇與乙酰輔酶A反應(yīng)[31]，從而增加乙酸酯含量。萜烯類化合物是水果的典型香氣特征，常以糖苷鍵結(jié)合的形式出現(xiàn)在獼猴桃中[32]。K-J8中新的萜烯類化合物為α-蒎烯(雪松、松木)。

WK中主要風(fēng)味化合物為戊醛(綠色、麥芽)、糠醛(杏仁、焦香)、(E)-2-己烯醛(綠色、青草)和己醛(青草)，較高的糠醛含量可能源于維生素C在無氧和熱的作用下形成糠醛[33]。而K-J8中主要為乙酸乙酯(甜香、菠蘿味)、3-甲基-1-丁醇(香蕉、花香)、乙醇(果香、花香)、1-己醇(花果香)、乙酸異戊酯(蘋果、香蕉)、2-甲基-丁醛(麥芽)和1-戊醇(水果香)，這些化合物均呈花香和果香，賦予獼猴桃豐富且濃郁的風(fēng)味。戊糖片球菌發(fā)酵后，獼猴桃中有3種新風(fēng)味化合物，分別為α-當(dāng)歸內(nèi)酯(甜草藥香)、乙酸糠酯和泛酸內(nèi)酯(棉花糖、烤面包)。乙酸糠酯被廣泛用作食品和面包房中的調(diào)味劑，可通過糠醇與乙酸的原位酯化形成[34]。綜上，戊糖片球菌J8發(fā)酵增加了獼猴桃的風(fēng)味物質(zhì)含量及種類，改善了獼猴桃的風(fēng)味。

2.5 發(fā)酵獼猴桃面包面團α-淀粉酶和蛋白酶活力變化

由圖2可知，WB的α-淀粉酶活和α-氨基態(tài)氮含量最低，而KB-J8的α-淀粉酶活力和α-氨基態(tài)氮含量較WKB分別提高了14.86%，18.63%，表明獼猴桃的添加和乳酸菌發(fā)酵均可提高α-淀粉酶和蛋白酶活力。其原因在于獼猴桃富含的有機酸和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的大量乳酸、乙酸等有機酸激活了小麥粉中內(nèi)源性α-淀粉酶和蛋白酶活力，同時乳酸菌自身也會分泌α-淀粉酶和蛋白酶[35]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.6 發(fā)酵獼猴桃面包的烘焙特性

由表6可知，與WKB相比，采用戊糖片球菌J8發(fā)酵的KB-J8的SDF含量提高了12.54%，這與其較高的β-葡萄糖苷酶酶活有關(guān)。β-葡萄糖苷酶是重要的纖維素水解酶，可促進纖維降解生成小分子可溶性多糖[36]，供乳酸菌和酵母菌利用。WKB面包比容最小，主要是因為纖維素會削弱或破壞面團面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致持氣能力降低。與WKB相比，KB-J8面包比容提高了18.59%，硬度下降了11.58%。添加獼猴桃后，面包皮L*值從72.10降至65.02，a*、b*值顯著增加(P<0.05)，ΔE均大于6，即獼猴桃的添加導(dǎo)致面包亮度減少，紅黃度增加，表皮顏色變化顯著，添加發(fā)酵獼猴桃后面包色澤進一步加深，與KB-J8中較高的α-淀粉酶和蛋白酶酶活相符。淀粉和面筋蛋白的水解使美拉德反應(yīng)底物含量增加，從而導(dǎo)致褐變，面包色澤變化更加明顯。

表6 不同面包烘焙特性評估?

2.7 發(fā)酵獼猴桃面包游離氨基酸含量

由圖3可知，相對于XB，WKB總游離氨基酸含量(57.00 mg/100 g)為XB的1.10倍，是因為獼猴桃本身含有多種氨基酸。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，KB-J8中總游離氨基酸含量達(dá)80.38 mg/100 g，與WKB相比提高了41.02%，與蛋白酶活性測定結(jié)果相符。支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)、芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)和含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)是形成風(fēng)味化合物的主要氨基酸[37]。KB-J8面包中纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸含量均比XB和WKB高，這5種物質(zhì)總量較WKB提升了2.32倍。通過Ehrlich途徑可將纈氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇和苯乙醇，而這3種物質(zhì)都是面包中重要的風(fēng)味物質(zhì)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.8 發(fā)酵獼猴桃面包滋味分析

由圖4(a)可知，WKB和KB-J8的整體滋味指標(biāo)顯著高于小麥面包，與獼猴桃較高的有機酸(蘋果酸和檸檬酸等)、糖類(葡萄糖、果糖)和呈味氨基酸含量有關(guān)。與WKB相比，KB-J8的酸味、甜味、鮮味、鮮味增加，澀味和苦味降低。WKB與KB-J8的甜味、酸味、滋味差異源于乳酸菌發(fā)酵代謝產(chǎn)酸、淀粉降解和較高含量的呈味氨基酸。KB-J8中較高含量的丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸可增加甜味，較高的谷氨酸和天冬氨酸含量可賦予鮮味同時還可抑制苦味。KB-J8的苦味和澀味值均低于WKB，與其較低的奎寧酸含量相關(guān)，奎寧酸閾值較低，對苦味和澀味貢獻(xiàn)較大。

由圖4(b)可知，主成分總方差貢獻(xiàn)率達(dá)95.96%，能反映樣品大部分信息。XB、WKB和KB-J8的整體滋味特性在主坐標(biāo)軸具有良好的區(qū)分度，WKB與苦澀味相關(guān)、而KB-J8與甜酸鮮咸味相關(guān)，說明發(fā)酵和未發(fā)酵獼猴桃的添加對面包整體滋味特性的提升具有顯著性差異(P<0.05)。

圖4 發(fā)酵獼猴桃面包的滋味特征及主成分分析

2.9 發(fā)酵獼猴桃面包揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量變化

由圖5(a)和表7可知，3組面包共檢出102種風(fēng)味物質(zhì)，包括39種醇類、10種酸類和22種酯類等。XB的種類和含量最低，KB-J8的種類和含量較WKB分別增加了45.10%和27.78%。

表7 面包風(fēng)味化合物含量?

續(xù)表7

續(xù)表7

圖5 面包的風(fēng)味化合物變化、維恩圖和熱圖

由圖5(b)可知，3組面包中均檢出25種共有風(fēng)味化合物，包括乙醇(果香、花香)、1-己醇(花果香)和辛酸乙酯(菠蘿、香蕉)等，主要以醇類為主。K-J8和KB-J8中均檢出17種共有化合物，包括3-甲基-1-丁醇(香蕉、花香)、2-甲基-1-丙醇(蘋果、麥芽)和乙酸乙酯(甜香，菠蘿)等，以醇類居多。將其中43種面包主要風(fēng)味物質(zhì)的含量標(biāo)準(zhǔn)化后進行聚類熱圖分析，由圖5(c)可知，不同揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量在不同面包中差異顯著(P<0.05)。

醇類化合物是面包風(fēng)味的重要組成部分。發(fā)酵后，KB-J8中乙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇和3-甲基-2-丁醇含量均顯著提升，與發(fā)酵獼猴桃風(fēng)味檢測結(jié)果相符。且KB-J8中纈氨酸和亮氨酸含量最高，這兩種氨基酸可通過Ehrlich途徑分別轉(zhuǎn)化形成2-甲基-1-丙醇和3-甲基-1-丁醇。KB-J8中產(chǎn)生了一些在WKB和XB中未檢出的新不飽和醛類物質(zhì)，如2-壬烯醛(黃瓜)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(黃瓜)和月桂醛(柑橘)等。這些不飽和烯醛類物質(zhì)閾值比飽和醛類更低，可賦予面包更加豐富、濃郁的風(fēng)味[38]。酯類化合物大多呈果香和花香，KB-J8中酯類種類和含量最高，WKB次之。KB-J8中還檢測到內(nèi)酯類化合物：壬基內(nèi)酯(桃子)和δ-癸內(nèi)酯(椰子、桃子)，內(nèi)酯可通過微生物作用、深度的脂類氧化或加熱形成。

2.10 發(fā)酵獼猴桃面包感官評價

由圖6可知，KB-J8的整體可接受度評分最高，而WKB的外觀評分最低，這與其低比容和高硬度有關(guān)。WKB中較高的總膳食纖維含量破壞了面團面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，苦澀味突出，因而組織結(jié)構(gòu)和口感評分較低。發(fā)酵后，WKB的比容與硬度得到改善，KB-J8的外觀飽滿、質(zhì)地松軟，外觀和口感評分均優(yōu)于WKB。KB-J8中因富含更多香氣物質(zhì)而獲得較高風(fēng)味評分(7.7)，其較高的游離氨基酸含量易于發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生令消費者喜愛的焦黃色澤，因此在色澤方面評分最高，與面包風(fēng)味化合物和顏色分析結(jié)果相符合。

圖6 面包感官評定

3 結(jié)論

利用酒鬼酒曲中篩選的戊糖片球菌J8發(fā)酵獼猴桃并制成面包。結(jié)果表明，經(jīng)戊糖片球菌J8發(fā)酵獼猴桃后，奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸含量均降低，乳酸和乙酸含量均顯著增加(P<0.05)；風(fēng)味物質(zhì)種類和含量均提高，以醇類、醛類和酯類化合物為主。獼猴桃中發(fā)現(xiàn)了3種新的風(fēng)味化合物：α-當(dāng)歸內(nèi)酯、乙酸糠酯和泛酸內(nèi)酯。與未發(fā)酵獼猴桃面包相比，發(fā)酵獼猴桃面包KB-J8面團的α-淀粉酶和蛋白酶活力分別提高了14.86%和18.63%，其面包的可溶性膳食纖維含量和總氨基酸分別增加了12.54%和41.02%。烘焙特性方面，KB-J8的比容提高了18.59%，硬度下降了11.58%。風(fēng)味特性方面，乳酸菌發(fā)酵后面包風(fēng)味物質(zhì)種類和含量增加，甜味、酸味、鮮味和咸味均優(yōu)于WKB，風(fēng)味特性整體得到改善，同時感官評價指標(biāo)得分均優(yōu)于WKB。說明該株戊糖片球菌J8發(fā)酵獼猴桃在增加可溶性膳食纖維含量，提升氨基酸含量，改善面包風(fēng)味和烘焙特性等方面具有良好的應(yīng)用潛力。后續(xù)可將該株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶戊糖片球菌與馬克斯克魯維酵母混菌發(fā)酵進一步改善發(fā)酵獼猴桃體系，實現(xiàn)混菌發(fā)酵的協(xié)同作用，改善發(fā)酵獼猴桃面包的烘焙品質(zhì)與香氣特征。