牛 野，張 躍，原明月，袁子民

（遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連 116600）

朝鮮淫羊藿為淫羊藿多基原藥材來源之一，其是小檗科植物朝鮮淫羊藿的干燥葉。由于不同基原淫羊藿所含成分的含量有所不同，2020 年版《中國藥典》中，巫山淫羊藿由于所含朝藿定C 含量較高，已單獨從淫羊藿藥材基原中單獨列出，只測定朝藿定C 含量；淫羊藿藥材其他基原的朝鮮淫羊藿、淫羊藿（心葉）、柔毛淫羊藿與箭葉淫羊藿，均以總黃酮、總黃酮醇苷（朝藿定A、B、C 和淫羊藿苷）為含量測定指標，由于朝鮮淫羊藿中總黃酮醇苷含量低于其他基原品種，故2020 年版《中國藥典》中對朝鮮淫羊藿總黃酮醇苷含量單獨制訂了限度標準[1-4]，但由于淫羊藿多基原藥材均含有朝藿定A、B、C 和淫羊藿苷，因此，僅從多成分含量測定尚不能完全實現(xiàn)朝鮮淫羊藿的溯源及與其他基原淫羊藿的鑒別區(qū)分。課題組前期在對不同基原淫羊藿特征圖譜的研究中發(fā)現(xiàn)，朝藿苷A 可作為朝鮮淫羊藿專屬特征性成分，淫羊藿藥材其他基原品種（巫山淫羊藿、淫羊藿、柔毛淫羊藿與箭葉淫羊藿）中均不含有該特征峰。因此，本文對遼寧省不同產(chǎn)區(qū)的朝鮮淫羊藿中朝藿苷A 的含量進行測定，為其藥材質(zhì)量標準提升的專屬性研究提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent-110 0 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；DFT-50 型高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；UV-301 0 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；SG-330 0 HDT 超聲波清洗機（上海冠特超聲儀器有限公司）；FAA100 4 型精密電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）。

1.2 試藥 朝藿苷A 對照品（實驗室自制，經(jīng)HPLC面積歸一化法測定含量＞98%）；遼寧省不同產(chǎn)區(qū)朝鮮淫羊藿藥材于2020 年6 月采收，其他不同基原的淫羊藿為市售，均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學中藥資源教研室尹海波鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔 毛 淫 羊 藿Epimedium pubescensMaxim.、朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai、巫山淫羊藿Epimedium wushanenseT.S.Ying的干燥葉；磷酸、甲醇為色譜純，水為市售純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以0.1%磷酸溶液-甲醇（45:55）為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；測定波長為270 nm；進樣體積為10 μL。

2.2 供試品的溶液 將不同基原淫羊藿藥材粉碎后過三號篩，各精密稱取0.2 g，分別置具塞三角瓶中，分別精密加入25 mL 的70%乙醇，稱重，超聲30 min，放冷，稱重補足失重，搖勻，高速離心，取續(xù)濾液[5]，即得不同基原淫羊藿供試品。

2.3 對照品的溶液 取適量的朝藿苷A 對照品，溶于甲醇，搖勻，制成濃度為61.7 μg/mL 的對照品溶液。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取對照品溶液1、2.5、5、10、15、20 μL，按2.1 項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，經(jīng)線性回歸，得標準曲線的方程為：Y=1 210.8X-24.58，朝藿苷A 在0.061 7～1.234 μg 范圍內(nèi)，呈良好的線性關系（r=0.999 6）。

2.5 專屬性試驗 分別稱取其他基原淫羊藿（淫羊藿、巫山淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿）藥材粉末，按2.3 項下的供試品溶液制備方法，同法制成其他不同基原淫羊藿供試品溶液，按2.1 項下色譜條件，依法測定，結(jié)果在朝藿苷相同保留時間處無相應色譜峰，表明朝藿苷A 可作為朝鮮淫羊藿的專屬特征性成分。色譜圖見圖1。

圖1 對照品及各基原淫羊藿供試品HPLC 色譜圖

2.6 加樣回收率試驗 平行稱定6 份0.1 g 已知含量為0.348%的藥材粉末，分別精密加入朝藿苷A 對照品溶液（濃度為61.7 μg/mL）6.0 mL 和70% 乙醇19.0 mL，按2.3 項下方法制備6 份供試品溶液。按2.1項下測定，結(jié)果回收率在97.2%～99.8%，RSD為1.0%，符合測定要求。

2.7 重復性試驗 分別取朝鮮淫羊藿粉末，平行配制6 份供試品溶液，測定朝藿苷A 的含量。結(jié)果平均含量為0.346%，RSD為1.29%，表明重復性良好。

2.8 精密度試驗 取同一供試品溶液，按2.1 中的色譜條件，分別進樣6 次，每次10 μL，測定朝藿苷A峰面積，計算該峰面積的RSD為1.15%，符合相關規(guī)定。

2.9 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別在不同時間（0，2，4，6，8，10 h）進樣10 μL，依法測定，記錄朝藿苷A 峰面積，RSD為1.93%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.10 樣品含量測定 取遼寧不同產(chǎn)區(qū)的朝鮮淫羊藿的藥材粉末，按2.2 項下方法制備4 份供試品溶液，依法測定，采用外標一點法計算朝藿苷A 的含量，結(jié)果見表1。

表1 朝藿苷A 含量測定結(jié)果（n =3） %

3 討論

3.1 特征性成分的確定 朝鮮淫羊藿主要分布于東北三省，吉林和遼寧產(chǎn)量較多，多為野生資源，且不同產(chǎn)地朝鮮淫羊藿藥材參差不齊[6-8]，現(xiàn)有研究對朝鮮淫羊藿的含量測定無法滿足其專屬性和特征性的要求。課題前期研究發(fā)現(xiàn)朝鮮淫羊藿含有兩個專屬特征性成分，能明顯區(qū)分于其他基原淫羊藿（巫山淫羊藿、箭葉淫羊藿、淫羊藿、柔毛淫羊藿），經(jīng)對其專屬特征性成分分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定與現(xiàn)有文獻比對確定為朝藿苷A 和朝藿苷B[9-10]，目前對二者的含量測定研究尚未見報道。由于朝藿苷B 含量較低，為了使得該實驗有顯著性的意義，故本文只對含量較高的朝藿苷A進行了含量測定。

3.2 檢測波長的確定 在對朝藿苷A 檢測波長的篩選中，通過參考文獻后[11]，在200～400 nm 將朝藿苷A的對照品溶液掃描測定，結(jié)果其分別在205、270、314、350 nm 波長處均有吸收，但270 nm 波長處有較強吸收，且色譜圖中未其他雜質(zhì)峰的干擾，故選擇270 nm 為檢測波長。

3.3 流動相的選擇 本研究中在對流動相篩選曾參考文獻報道中朝鮮淫羊藿中朝藿甙甲與朝藿甙乙的制備分離時采用的流動相甲醇-水（64:36）的等度洗脫條件[12]，但由于朝藿苷A 和朝藿苷B 為同分異構(gòu)體，極性相近，該流動相無法將二者分離，為了使色譜峰達到較好的分離，本研究經(jīng)過對流動相的篩選，最終采用甲醇-0.1%磷酸溶液（55:45）作為流動相。

3.4 含量比較 本文通過HPLC 法測定朝鮮淫羊藿中朝藿苷A 的含量初步得出結(jié)論，不同產(chǎn)地朝藿苷A 含量有所差異，本溪桓仁含量最高，丹東寬甸的含量最低，為了使得結(jié)果更加具有代表性，對其含量的測定研究將在后續(xù)工作中繼續(xù)進行。