鄭丹妮，陳思哲，吳芷玥，張一涵，崔 瑜，薛 闖，康 巍*

（1.大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學(xué)寧波研究院，浙江 寧波 116038；3.石家莊第三醫(yī)院，石家莊 050011）

α-法尼烯（C15H24）是一種倍半萜烯[1]，多項(xiàng)研究表明其在多種中草藥，如姜黃[2-4]、陳皮[5]、江香薷[6]、檀香[7]發(fā)揮著重要功能。例如，姜黃具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖等作用，其主要功效成分為酚酸類(lèi)和萜烯類(lèi)物質(zhì)[3]，已有研究對(duì)姜黃的功能成分及主要藥理活性進(jìn)行分析，結(jié)果表明姜黃揮發(fā)油中的倍半萜類(lèi)物質(zhì)可以起到抗氧化、抗感染的良好功效，其中的倍半萜主要為α-法尼烯[2]。α-法尼烯主要存在于水果表皮[8]。利用合成生物學(xué)方法在異源微生物細(xì)胞工廠中生產(chǎn)α-法尼烯具有安全、節(jié)能、綠色環(huán)保、產(chǎn)物純度高等優(yōu)勢(shì)[9]。已有研究利用大腸桿菌[9]、畢赤酵母[10]實(shí)現(xiàn)α-法尼烯在異源微生物中的合成。

目前，α-法尼烯的主要檢測(cè)方法有固相萃取-比色法[11]、氣相色譜法[12-13]、高效液相色譜法[14]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法 [15]等。2011 年，Seon-Won Kim 團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種人工合成α-法尼烯合酶的基因，但是該研究間接的用反式α-法尼烯為標(biāo)準(zhǔn)化合物對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析[16]。2021 年，江南大學(xué)石貴陽(yáng)研究團(tuán)隊(duì)采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)α-法尼烯進(jìn)行定量分析[14]，但是α-法尼烯沸點(diǎn)為260 ℃，是一種具有揮發(fā)性的物質(zhì)，因此基于GC-MS 的分析方法更適合用于分析該揮發(fā)性產(chǎn)物。然而，目前還缺乏一種快速、靈敏的基于GC-MS 的α-法尼烯檢測(cè)方法，特別是針對(duì)于成分復(fù)雜的細(xì)胞提取液中的法尼烯的檢測(cè)。

本研究選擇廣泛使用的大腸桿菌工程菌株作為細(xì)胞工廠，通過(guò)一種源自蘋(píng)果的α-法尼烯合酶（alphafarnesene synthase），利用E.coli 自身胞內(nèi)代謝產(chǎn)物法尼基焦磷酸作為底物生產(chǎn)中草藥功能成分α-法尼烯；利用正十二烷對(duì)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行萃取，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)細(xì)胞提取物進(jìn)行分析，對(duì)α-法尼烯產(chǎn)量進(jìn)行定量分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 α-法尼烯合酶（aFS）基因來(lái)源于Malus domestica，經(jīng)過(guò)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后，由金唯智合成。含His6 基因的pET28a 質(zhì)粒來(lái)自實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑 α-法尼烯標(biāo)準(zhǔn)化合物購(gòu)自加拿大Toronto Research Chemicals；2YT 培養(yǎng)基，LB 培養(yǎng)基購(gòu)于上海賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），卡那霉素（Kan）購(gòu)于上海生工生物工程（上海）股份有限公司；用于DNA 片段純化及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Omega 生物科技公司；蛋白質(zhì)凝膠制備試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；免疫印跡相關(guān)抗體來(lái)自美國(guó)abcam 公司。

1.1.3 主要儀器 PCR 儀購(gòu)于德國(guó)Sensoquest 有限公司；蛋白質(zhì)電泳及凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司；NanoDrop One 用于定量DNA，蛋白質(zhì)及OD600，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀用于檢測(cè)α-法尼烯生產(chǎn)于上海賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 將進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的α-法尼烯合酶基因合成并通過(guò)同源重組的方法克隆到含有His6 的pET28a 載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行PCR 檢測(cè)，挑選陽(yáng)性克隆菌株進(jìn)行質(zhì)粒抽提。

1.2.2 α-法尼烯合酶表達(dá) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌Bl21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，于含Kan 抗性（終濃度50 mg/L）的LB 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆菌落接種至5 mL含Kan抗性的2YT培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h。取1 mL 活化菌液接種至100 mL 含Kan 抗性、3%（v/v）甘油的2YT 培養(yǎng)基中，在37 ℃下200 r/min 培養(yǎng)至OD600 達(dá)到0.6～0.8，添加終濃度0.1 mM IPTG 溶液調(diào)整至29 下誘導(dǎo)aFS 表達(dá)。誘導(dǎo)3 h 后，在培養(yǎng)基中加入5 mL 正十二烷覆蓋。誘導(dǎo)24 h后，取2 mL 油水混合物，經(jīng)12 000 g 離心5 min，取上層有機(jī)相進(jìn)行GC-MS 分析；取菌體用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）分析。

1.2.3 鑒定α-法尼烯合酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá) 取Bl21（DE3）空白菌體、未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的表達(dá)菌體，誘導(dǎo)后菌體的破碎后沉淀及上清液，分別與SDS 上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。通過(guò)使用對(duì)應(yīng)的一抗、二抗識(shí)別，進(jìn)行Western blotting 分析。

1.2.4 GC-MS 檢測(cè)α-法尼烯 采用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測(cè)儀器。按照表1 中GC-MS 分析條件進(jìn)行測(cè)試。以正十二烷為溶劑，對(duì)α-法尼烯標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?biāo)準(zhǔn)濃度曲線，用于對(duì)aFS 催化產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。

表1 α-法尼烯GC-MS 分析條件

2 結(jié)果

2.1 α-法尼烯合酶的生物信息學(xué)分析 通過(guò) NCBIBLAST 程序?qū)?α-法尼烯合酶的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，并用pymol 對(duì)其空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，相關(guān)位點(diǎn)如圖1。

圖1 α-法尼烯合酶的序列和結(jié)構(gòu)分析

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 通過(guò)特異性引物，運(yùn)用PCR 技術(shù)得到aFS 片段和含His6 的pET28a 片段。將其進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)化后，使用通用引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)，如圖2 經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)在2 000 bp 附近有特異性條帶，分子大小于理論值相一致。將抽提的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，序列與基因庫(kù)序列一致。以上結(jié)果表明重組pET28a-aFS 質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 核酸電泳圖

2.3 酶的表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET28a-aFS 質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）菌株，在29 ℃經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)。經(jīng)10%的SDS-PAGE 分析，可見(jiàn)大小約為80 kD 的目標(biāo)條帶。融合蛋白可以與Anti-His6 抗體特異性結(jié)合，并用對(duì)應(yīng)二抗進(jìn)行識(shí)別，結(jié)果如圖3 表明該蛋白成功表達(dá)，并部分存在于裂解上清液中。

圖3 Western-blot 驗(yàn)證

2.4 GC-MS 檢測(cè)

2.4.1 GC-MS 可檢測(cè)到α-法尼烯標(biāo)品 以正十二烷為溶劑配制濃度為0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 mg/L 的α-法尼烯標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，氣相色譜結(jié)果如圖4，可見(jiàn)α-法尼烯出峰位置為9.21 min。α-法尼烯標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，如圖5。

圖4 α-法尼烯標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS 峰圖

圖5 α-法尼烯標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線

2.4.2 GC-MS 分析大腸桿菌萃取液中的產(chǎn)物 將大腸桿菌發(fā)酵液進(jìn)行離心，取上層正十二烷提取液，按上述檢測(cè)條件進(jìn)行GC-MS 分析，由色譜結(jié)果（如圖6）可知在萃取液檢測(cè)到有α-法尼烯的生產(chǎn)。

圖6 大腸桿菌發(fā)酵提取液的GC-MS 峰圖

本研究建立直接、快速、靈敏、微量的 α-法尼烯檢測(cè)方法，并通過(guò)大腸桿菌對(duì) α-法尼烯合酶進(jìn)行過(guò)表達(dá)，檢測(cè)到該酶的可溶性表達(dá)，并通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用對(duì)其催化產(chǎn)物 α-法尼烯進(jìn)行定量分析，對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證。

3 討論

α-法尼烯是多種中草藥中的重要有效成分，多項(xiàng)研究表明其具有抗炎、抗氧化活性。利用生物合成法生產(chǎn)法尼烯具有低碳、綠色、環(huán)保、產(chǎn)率高的特點(diǎn)。本研究的結(jié)果表明，通過(guò)在大腸桿菌中構(gòu)建代謝通路可以大量獲得α-法尼烯，產(chǎn)量達(dá)到3.63 mg/L ?；谥把芯?，大部分實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)選擇以反式β-法尼烯作為標(biāo)品，存在檢測(cè)復(fù)雜，步驟繁瑣等問(wèn)題。本研究成功在大腸桿菌中表達(dá)了α-法尼烯合酶，以大腸桿菌中MEP 途徑的代謝產(chǎn)物FPP 為底物實(shí)現(xiàn)了 α-法尼烯的合成，并完成 α-法尼烯的微量定量，產(chǎn)物的提取和定量分析。該研究為進(jìn)一步闡明α-法尼烯在多種中草藥中的功能，拓展α-法尼烯在疾病治療中的應(yīng)用場(chǎng)景奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。