蒙 蒙，胡冠宇，婁惠娟，張予心，王宇峰，叢德毓*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.南方醫(yī)科大學(xué)，廣州 510630；3.吉林省中醫(yī)院，長(zhǎng)春 130021 ）

腦卒中是全球第二大死亡的主因，也是致殘的首要因素，在亞洲國(guó)家，腦卒中的發(fā)生情況正在逐年增加[1]，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性的腦血流循環(huán)障礙性疾病范疇，包括出血性和缺血性兩種，缺血性腦卒中是主要發(fā)病類型，占發(fā)病人群的85%左右，給患者的正常生活帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)與威脅[2]。腦缺血再灌注損傷是由于腦部的出血被阻斷，血液再次被灌流到 腦缺血的半暗部，從而進(jìn)一步加重腦組織損傷程度，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生損傷和壞死[3]。研究認(rèn)為，細(xì)胞自噬發(fā)生在腦缺血再灌注階段，參與了腦神經(jīng)組織與細(xì)胞的損傷和凋亡過(guò)程[4]，因此調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬是醫(yī)治與預(yù)防腦缺血再灌注損傷的潛在治療靶點(diǎn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，推拿手法有增加局部血流量，促使受損神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)的作用。本實(shí)驗(yàn)以建立腦缺血再灌注動(dòng)物模型為前提，以推拿手法作為干預(yù)手段，初步探討推拿手法調(diào)節(jié)自噬蛋白Beclin 1 的表達(dá)來(lái)影響腦卒中的治療，為臨床治療提供了豐富的科研數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)成年雄性Sprague-Dawley 大鼠共30 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（220±20）g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司供貨[SCXK（吉）-2018-0007]。動(dòng)物購(gòu)回后，進(jìn)食和攝水不受限制。持續(xù)性飼養(yǎng)1 周后造模。

1.2 造模方法 建立能模擬人的缺血性卒中再灌注大鼠（MCAO/R）模型[5]，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，禁食不禁水12 h。在手術(shù)后1 d，采用Zealonga[6]評(píng)分的方法來(lái)篩選，得分在1～3 分后納入。

1.3 動(dòng)物分組及干預(yù)

1.3.1 動(dòng)物分組 按順序隨機(jī)抽取大鼠20 只，建立MCAO/R 模型。造模后平均隨機(jī)分為模型組和推拿組，推拿治療組為進(jìn)行手法刺激，其他2 組僅作為觀察不做處理。

1.3.2 推拿手法治療 在造模成功后進(jìn)行手法刺激，根據(jù)華興邦等編著的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腧穴圖譜》來(lái)確定推拿組大鼠進(jìn)行穴位操作的準(zhǔn)確位置，選擇頭頂部百會(huì)、神庭，腿部足三里，點(diǎn)按法操作每次10 min，每日1 次。于每日上午9 點(diǎn)進(jìn)行推拿手法刺激，連續(xù)治療，14 d后動(dòng)物處死、取樣本。

1.4 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.4.1 行為學(xué)檢測(cè) 在造模1 d、3 d、7 d、14 d 后以ZeaLonga 評(píng)分法對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)估。

1.4.2 TTC 測(cè)量 推拿后14 d，每組大鼠腹腔注射過(guò)量麻藥后，將腦組織快速取出，暫時(shí)冷凍后，連續(xù)5 次切成2 mm 后的腦片，TTC 染色后拍照，用Image J 圖像分析軟件來(lái)測(cè)量各組腦組織梗死體積占比分布情況。

1.4.3 TUNEL 染色 再灌注后14 d，取患側(cè)腦組織，根據(jù)TUNEL 染色試劑盒說(shuō)明書加入染料，利用激光共聚焦顯微鏡拍取圖像，檢測(cè)腦神經(jīng)凋亡的情況。

1.4.4 Western Blot、qPCR 檢測(cè)各組大鼠腦皮質(zhì)的Beclin 1、Beclin 1mRNA 的表達(dá)情況 再灌注后14 d，冰下取鼠腦組織，凍于-80℃中，用以檢測(cè)Becliln 1 的蛋白及mRNA 含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示計(jì)量資料，單因素方差分析用于2 組間的比較，治療前后的比較用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組間神經(jīng)功能評(píng)分比較 見(jiàn)表1。推拿法治療可以有效改善病鼠腦卒中后的神經(jīng)功能狀況。

表1 各組間神經(jīng)功能評(píng)分比較（，n =10）

表1 各組間神經(jīng)功能評(píng)分比較（，n =10）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.2 各組大鼠腦梗死情況評(píng)價(jià) 見(jiàn)表2，圖1 所示。圖中紅色部分顯示正常腦組織，蒼白的部位則為梗死區(qū)域；肉眼觀察假手術(shù)組沒(méi)有明顯梗死區(qū)域；模型組則有較大范圍的缺血性梗死灶，較模型組梗死灶體積來(lái)說(shuō)，推拿組的梗死灶體積有明顯的減少。

表2 各組間腦梗死面積比較（）

表2 各組間腦梗死面積比較（）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

圖1 各組大鼠TTC 染色結(jié)果

2.3 TUNEL 法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡 在光學(xué)顯微鏡下來(lái)觀測(cè)各組大鼠腦組織的凋亡情況。如圖2 所示，治療14 d 后，存在大量凋亡細(xì)胞的為模型組，幾乎沒(méi)有陽(yáng)性凋亡細(xì)胞的為假手術(shù)組，細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多的為模型組；治療組的凋亡細(xì)胞較模型組有所降低。

圖2 各組大鼠TUNEL 染色結(jié)果

2.4 推拿治療對(duì)MCAO/R 大鼠腦組織中Beclin 1 蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表3，圖3。結(jié)果顯示，治療14 d 后，推拿組的蛋白表達(dá)比另2 組有明顯升高。

表3 各組間Beclin 1 蛋白水平比較（，n =3）

表3 各組間Beclin 1 蛋白水平比較（，n =3）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

圖3 各組大鼠Beclin 1 蛋白水平比較

2.5 推拿治療對(duì)MCAO/R 大鼠腦組織中Beclin 1 mRNA 表達(dá)的影響 如表4。結(jié)果顯示，治療14 d 后，推拿組大鼠腦皮質(zhì)Beclin 1 mRNA表達(dá)較模型組增加。

表4 各組間Beclin 1mRNA 比較（，n =6）

表4 各組間Beclin 1mRNA 比較（，n =6）

注：與模型組比較，△△ P ＜0.01

3 討論

腦卒中在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“中風(fēng)病”范疇，在《內(nèi)經(jīng)》中有較為詳盡的記載，古代醫(yī)家認(rèn)為其病因病機(jī)可分為：“外風(fēng)”“內(nèi)風(fēng)致病”“內(nèi)傷外感同時(shí)致病”等理論，現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為中風(fēng)是多因素綜合作用的結(jié)果，其發(fā)生多與所處的內(nèi)外環(huán)境具有緊密的關(guān)系。但從總體上看，它屬于本虛標(biāo)實(shí)。文獻(xiàn)記載，“陽(yáng)脈之?！薄安∽冇谀X，首選督脈”，以往有學(xué)者也證實(shí)百會(huì)能減少腦梗死的體積和加強(qiáng)神經(jīng)功能的評(píng)分，并在缺血性中風(fēng)中發(fā)揮潛在的神經(jīng)保護(hù)的治療作用[7]，并在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病上發(fā)揮了重要的作用[8]，同時(shí)神庭與百會(huì)相配，可以起到促進(jìn)睡眠的作用，從而幫助腦神經(jīng)遞質(zhì)的修復(fù)[9]。足三里可以起到增強(qiáng)體質(zhì)的作用，同時(shí)運(yùn)用點(diǎn)按法作用于各穴位，可加強(qiáng)氣血的運(yùn)行，進(jìn)一步加強(qiáng)身體的修復(fù)能力。因此本實(shí)驗(yàn)基于“形神并重”的治療理念，采用“治神調(diào)形”的中醫(yī)治療原則，擇百會(huì)作為主穴，同時(shí)配伍神庭、足三里[10]。通過(guò)推拿按揉頭部百會(huì)、神庭，腿部足三里，達(dá)到行氣活血，通調(diào)經(jīng)脈，補(bǔ)虛瀉實(shí)，陰陽(yáng)協(xié)調(diào)的作用，從而加快中風(fēng)的康復(fù)。有研究[11]證明，百會(huì)和足三里配合以JAK2/STAT3 為通路來(lái)對(duì)腦缺血的大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。

Beclin 1 是atg6 的哺乳動(dòng)物同源物。Beclin 1 的翻譯后調(diào)控被干擾可能是調(diào)控自噬程度的一種途徑[12]。Beclin 1 不僅是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵因子，也可增強(qiáng)PI3K的活性。影響它的表達(dá)程度，對(duì)治療腦缺血的各種疾病有著重要的意義[13-16]。推拿手法在腦卒中的恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了不可替代的作用，相對(duì)比康復(fù)技術(shù)來(lái)說(shuō)，推拿手法的操作更簡(jiǎn)便，不受時(shí)間和地點(diǎn)等條件限定。經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究表明腦缺血大鼠的神經(jīng)損傷及梗死灶是可以通過(guò)及時(shí)進(jìn)行推拿手法的干預(yù)來(lái)改善，根據(jù)蛋白檢測(cè)和熒光染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)推拿手法可以明顯增加大鼠腦內(nèi)Beclin 1 蛋白及mRNA 含量的表達(dá)，從細(xì)胞自噬的角度說(shuō)明了推拿手法可以增加自噬的表達(dá)，起到保護(hù)腦神經(jīng)和預(yù)防腦卒中的作用，為臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，為進(jìn)一步探索推拿手法通過(guò)各種通路影響自噬因子的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，推拿手法可以調(diào)節(jié)Beclin 1 蛋白及mRNA 含量的表達(dá)，并改善腦細(xì)胞凋亡情況，從而起到對(duì)缺血性腦卒中的治療作用。