范春惠，張琳惠，鄭 妮

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，杭州 310000；2.南方科技大學(xué)醫(yī)院，廣東 深圳 518000）

2 型糖尿?。═2DM）發(fā)病機(jī)制主要是前期的胰島素抵抗和后期的胰島細(xì)胞功能障礙或受損凋亡[1]。隨著T2DM 病程的發(fā)展，胰島細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，胰島功能受損逐漸加劇，而胰腺細(xì)胞凋亡是其數(shù)量減少、胰島素分泌功能下降的主要因素之一[2]。杜仲黃酮是杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliver）的干燥樹皮中提取的主要成分。研究[3-4]表明，杜仲黃酮有良好的降糖、抗氧化應(yīng)激效果，本研究基于課題組前期研究（通過尾靜脈注射鏈脲佐菌素聯(lián)合高脂高糖飲食共同誘導(dǎo)構(gòu)建糖尿病小鼠模型）結(jié)果，探討杜仲黃酮對T2DM 小鼠胰腺凋亡因子的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性昆明小鼠，SPF 級，體質(zhì)量18～22 g，購自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK（浙）2019-0023。小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好環(huán)境，室溫18～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h 光照晝夜循環(huán)。實(shí)驗(yàn)開始前小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 藥物及試劑 鹽酸二甲雙胍片（京豐制藥有限公司，批號：191115）；STZ（美國Sigma 公司，批號：B1863）；白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細(xì)胞凋亡因子Fas、可溶性細(xì)胞凋亡因子配體Fasl、C-肽、氧自由基（ROS）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20200918、20200925、20200927、20200908、20200911、20200906）；Bcl-2、Bax 一抗（英國Abcam 公司，批號：B2011、B2017）；杜仲黃酮提?。翰捎么继崛》ㄌ崛《胖冱S酮。首先將干燥杜仲進(jìn)行充分粉碎，粉碎藥材置于容器中采用70%乙醇（藥材:70%乙醇=1:15），在80 ℃條件下加熱回流提取2 h，連續(xù)提取3 次。將提取液進(jìn)行過濾濃縮，獲得干燥杜仲黃酮提取物。

1.3 主要儀器 9602A-酶標(biāo)儀（北京艾普生物設(shè)備有限公司）；羅氏卓越型血糖儀（瑞士ACCU-CHEK Performa）；Mini-Protean Tetra 垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜顯影設(shè)備、GelDoc EZ 凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.4 方法

1.4.1 T2DM 小鼠模型建立 雄性小鼠禁食不禁水12 h，用4℃枸櫞酸緩沖液（pH=7.4）溶解的STZ 溶液，尾靜脈注射STZ（25 mg/kg）。注射后繼續(xù)予高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周，檢測小鼠空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG ≥11.1 mmol/L 為T2DM 模型成功[5]。

1.4.2 分組及給藥 將造模成功的T2DM 模型小鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組（32 mg/kg）、杜仲黃酮低劑量組（80 mg/kg）、杜仲黃酮高劑量組（160 mg/kg），每組10 只。另以健康昆明小鼠為空白對照組。各組予相對應(yīng)藥物灌胃60 d，每日1 次。模型組和正常對照組小鼠予等體積生理鹽水灌胃。

1.5 觀察指標(biāo) 末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，測其FBG。切取部分胰腺組織，Tunel 染色觀察細(xì)胞凋亡情況。ELISA 法檢測血清中空腹C-肽含量以及胰腺中炎癥因子IL-6、TNF-α、跨膜蛋白Fas 及配體Fasl 含量。Western blot 檢測胰腺中促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子Bax 和抑制細(xì)胞凋亡因子Bcl-2 表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，采用Kruska-Wallis H秩和檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠給藥前后FBG 指標(biāo)變化比較 與空白組比較，模型組小鼠FBG 明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍、杜仲黃酮組小鼠FBG 均降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠給藥前后FBG 指標(biāo)變化比較（，n =10）

表1 各組小鼠給藥前后FBG 指標(biāo)變化比較（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05

2.2 各組小鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡情況比較 與空白組比較，模型組小鼠胰腺有大量凋亡陽性細(xì)胞（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍、杜仲黃酮組小鼠胰腺凋亡陽性細(xì)胞較模型組少（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡情況比較

2.3 各組小鼠胰腺中炎癥因子與跨膜蛋白及其配體含量比較 與空白組比較，模型組小鼠胰腺中炎癥因子IL-6、TNF-α 與跨膜蛋白Fas 及其配體Fasl 的含量增加（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍、杜仲黃酮組小鼠胰腺中IL-6、TNF-α、Fas、Fasl 含量減少（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠胰腺中炎癥因子與跨膜蛋白及其配體含量比較（，n =10）

表2 各組小鼠胰腺中炎癥因子與跨膜蛋白及其配體含量比較（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05

2.4 各組小鼠胰島功能及胰腺中ROS 含量變化比較 與空白組比較，模型組小鼠血清中空腹C-肽含量減少，胰腺中ROS 含量增加（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍、杜仲黃酮組小鼠血清中空腹C-肽含量增加，胰腺中ROS 含量降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠胰島功能及胰腺中ROS 含量變化比較（，n =10）

表3 各組小鼠胰島功能及胰腺中ROS 含量變化比較（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05

2.5 各組小鼠胰腺促凋亡因子Bax、抑凋亡因子Bcl-2表達(dá)比較 與空白組比較，模型組小鼠胰腺中促凋亡因子Bax 表達(dá)增加、抑凋亡因子Bcl-2 表達(dá)減少（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍、杜仲黃酮組小鼠胰腺中促凋亡因子Bax 表達(dá)減少、抑凋亡因子Bcl-2表達(dá)增加（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠胰腺促凋亡因子Bax、抑凋亡因子Bcl-2表達(dá)比較（，n =10）

表4 各組小鼠胰腺促凋亡因子Bax、抑凋亡因子Bcl-2表達(dá)比較（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05

3 討論

胰島細(xì)胞是機(jī)體分泌胰島素，調(diào)控血糖的重要細(xì)胞器，其對各類應(yīng)激損傷、促凋亡刺激均極度敏感，而T2DM 的發(fā)病及病程發(fā)展與胰島細(xì)胞凋亡有關(guān)[6]。正常生理情況下，細(xì)胞凋亡是維持機(jī)體穩(wěn)定，清除損傷及多余細(xì)胞的有序性死亡。其凋亡路徑主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑、死亡受體介導(dǎo)的路徑、線粒體路徑、顆粒酶 B 途徑等[7]。在T2DM 的發(fā)病及病程發(fā)展中，胰島細(xì)胞凋亡的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑是線粒體路徑[8]。Bcl-2 蛋白家族中各個蛋白及其亞型與線粒體膜相結(jié)合，在凋亡的過程中起到不同的作用。

促凋亡因子Bax 和抑凋亡因子Bcl-2 是 Bcl-2 家族中重要的凋亡的因子。Bax 與Bcl-2 的比值間接反映了細(xì)胞受凋亡因子調(diào)節(jié)的程度[9]。T2DM 狀態(tài)下，Bcl-2與Bax 之間的表達(dá)平衡被破壞，胰腺細(xì)胞線粒體外膜的寡聚體轉(zhuǎn)化增多，孔模形成，線粒體外膜通透性增加，促使線粒體內(nèi)膜的細(xì)胞色素C 透過線粒體外膜上的孔模釋放到胞質(zhì)中[10]。線粒體內(nèi)部細(xì)胞色素C 的外排導(dǎo)致其內(nèi)部能量喪失，影響線粒體正常功能；細(xì)胞質(zhì)中過量的細(xì)胞色素C 與凋亡蛋白酶激活因子1、Caspase-9、ATP 形成凋亡體，激活跨膜蛋白Fas 與其受體Fasl 結(jié)合，活化Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等凋亡因子，引起非蛋白溶解級聯(lián)反應(yīng)，使胰腺細(xì)胞解體而發(fā)生凋亡[11]。本研究結(jié)果表明，杜仲黃酮能降低糖尿病小鼠空腹血糖，減少胰腺組織中跨膜蛋白Fas配體Fasl 的含量，抑制凋亡因子Bcl-2 表達(dá)增加，促凋亡因子Bax 表達(dá)減少。

氧化應(yīng)激是 T2DM 發(fā)病及病程進(jìn)展的關(guān)鍵因素，也是導(dǎo)致胰島細(xì)胞功能衰退及細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵原因[12]。其通過多元醇通路、生物氧化和線粒體電子傳遞鏈等途徑增加機(jī)體內(nèi)的ROS 含量，造成胰腺細(xì)胞及蛋白和核酸等生物大分子損傷，細(xì)胞內(nèi)的線粒體結(jié)構(gòu)受損壞及功能出現(xiàn)障礙，直接或間接損傷胰腺β 細(xì)胞，使胰島細(xì)胞功能下降，加速其凋亡，影響胰島素分泌[13]。炎癥是胰島素抵抗與胰島β 細(xì)胞凋亡的重要橋梁。T2DM狀態(tài)下，胰腺β細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)信號通路被激活，促進(jìn)各種炎癥因子TNF-α、IL-6 釋放，導(dǎo)致胰島素抵抗或胰島β 細(xì)胞凋亡[14-15]。本研究結(jié)果表明，杜仲黃酮能降低胰腺組織中ROS 及炎癥因子TNF-α、IL-6 的含量。

綜上所述，杜仲黃酮能增加血清中C-肽含量，減少胰腺中TNF-α、IL-6、ROS、Fas、Fasl含量及Bax表達(dá)，增加Bcl-2 表達(dá)，改善炎癥因子及氧化應(yīng)激對胰腺病理損傷，提高胰島功能，其作用機(jī)制與杜仲黃酮通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑中的相關(guān)凋亡因子及跨膜蛋白表達(dá)，減少胰腺細(xì)胞凋亡有關(guān)。