邱娟娟，李玉春，邱 陽，郭 莉，劉越堅，萬嘉嘉，熊永建，吳國鍇，郭慧淑

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室，遼寧 大連 116011）

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是臨床常見的胃腸道紊亂的功能性疾病[1]。功能性消化不良發(fā)病率高，但病因病機未完全明確。功能性消化不良盡管不會危及生命安全，但是嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。胃腸動力障礙是FD 主要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。四磨湯是治療功能性消化不良的常用中藥方劑[2]。本實驗觀察功能性消化不良模型大鼠胃RhoA 及ROCK 表達的變化，初步探討RhoA 及ROCK 與功能性消化不良發(fā)病機制的關(guān)系及四磨湯干預(yù)作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200 ± 20）g，清潔級；出生7 日SD 乳鼠，清潔級。大鼠與乳鼠均購于大連醫(yī)科大學(xué)SPF 動物中心。

1.1.2 主要試劑及儀器 Y27632（Selleck）；四磨湯口服液（湖南漢森制藥股份有限公司）；碘乙酰胺和蔗糖（Sigma）；RNA 提取的試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-time PCR 試劑盒（大連寶生物公司）；小平臺；Stepone plus 熒光定量PCR 儀（ABI）。生物多道記錄儀（BIOPAC）。

1.2 胃平滑肌縱行肌條收縮作用檢測 健康雄性SD 大鼠禁食24 h，不禁水。采用10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g 體質(zhì)量）麻醉大鼠，取出全胃。用剪刀沿胃小彎打開胃，用Krebs 液漂洗。去除黏膜層，取平行于胃縱行肌纖維走向的10 mm×1.5 mm 肌條，固定于37℃恒溫灌流槽內(nèi)，Krebs 液灌流，并持續(xù)通入95% 氧氣和5% 二氧化碳混合氧，利用生物多道記錄儀記錄胃縱行平滑肌自發(fā)性收縮活動。用37 ℃新鮮的Krebs 液持續(xù)灌流，孵育60 min 左右，自發(fā)性收縮穩(wěn)定出現(xiàn)后開始實驗，加入終濃度1.49×10-4g/mL 四磨湯口服液，描記大鼠胃縱行平滑肌的收縮曲線，洗脫，當(dāng)肌條穩(wěn)定的自發(fā)性收縮出現(xiàn)后，加入終濃度50 μM的抑制劑Y27632 記錄大鼠胃縱行平滑肌的收縮曲線，穩(wěn)定10 min 后，再次加入終濃度1.49×10-4g/mL 四磨湯口服液，描記大鼠胃縱行平滑肌的收縮曲線變化。觀察胃縱行平滑肌收縮的頻率變化。

1.3 造模及處理

1.3.1 造模 7 日SD 乳鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。晝夜各保持12 h，室溫22.0～24.0 ℃，保持安靜，每籠一母鼠帶5只乳鼠。造模開始，正常組：每日每只0.2 mL 的2%蔗糖溶液灌胃，連續(xù)灌胃6 d。模型組：每日每只0.2 mL 的0.1% 碘乙酰胺蔗糖溶液灌胃，連續(xù)灌胃6 d[3]，同時模型組乳鼠與母鼠每天分離3 h 至3 周齡[4]。3 周齡時，剔除母鼠，分籠，每籠5 只，常規(guī)鼠飼料喂養(yǎng)。6 周齡時，模型組大鼠每日22:00－次日7:00置入水環(huán)境小平臺站立[5]，以剝奪睡眠造成勞倦，14 d 完成站立；正常大鼠組正常喂養(yǎng)。

1.3.2 動物分組及處理 造模完成后分組，分正常組、模型組和四磨湯組。正常組與模型組每天定時2 mL/100（g·d）的生理鹽水；四磨湯組每天定時0.09 g/100（g·d）的四磨湯；連續(xù)給藥7 d。

1.4 模型大鼠監(jiān)測

1.4.1 曠場實驗 大鼠造模后進行曠場試驗，保持環(huán)境安靜，遮光簾隔離實驗室，實驗前大鼠在實驗條件下適應(yīng)0.5 h，實驗時將大鼠放置在曠場中央格，讓其先適應(yīng)3 min，然后進行攝像計時，觀察3～5 min 后停止攝像，記錄大鼠3 min 內(nèi)穿格次數(shù)（大鼠三爪及以上穿過相鄰格子的次數(shù)）和站立次數(shù)（大鼠兩前肢向上抬起離開曠場箱底面或搭在箱側(cè)壁的次數(shù)）。每只大鼠記錄完畢，用酒精清洗曠場箱并晾干，以免殘留動物的信息影響下次結(jié)果。實驗時保證實驗室光照及溫度與濕度適宜及隔音，實驗在同一時間段進行，以免大鼠活動周期影響實驗。

1.4.2 糖水消耗試驗 大鼠造模后進行糖水消耗試驗。保持環(huán)境安靜，訓(xùn)練大鼠適應(yīng)含糖飲水。每籠放置2個水瓶。第1 個24 h，2 瓶均裝入1%蔗糖水，第2 個24 h，1 瓶裝1%蔗糖水，1 瓶裝純水。隨后24 h 禁食禁水后，給予每只大鼠定量的1%蔗糖水1 瓶，純水1瓶。1 h后，取2瓶水定量測定并計算動物的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗量及糖水偏愛（糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%）。

1.5 熒光定量 PCR 法檢測大鼠胃組織RhoA 及ROCK的mRNA 水平表達 取大鼠胃組織，提取總mRNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA 作為熒光定量PCR 反應(yīng)的模板，根據(jù)待測基因的序列設(shè)計引物，見表1。反應(yīng)后，通過 PCR分析軟件對結(jié)果進行實時定量分析，RhoA，ROCK1和ROCK2 的相對表達量采用 2－△△Ct計算。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 胃縱行平滑肌肌條收縮的活動 胃平滑肌肌條的收縮曲線圖顯示四磨湯能增強胃平滑肌的收縮；抑制劑Y27632 作用后，四磨湯對胃平滑肌肌條的收縮的頻率較之前作用明顯減慢。見圖1，圖2。

圖1 大鼠胃平滑肌肌條自發(fā)性收縮活動

圖2 大鼠胃平滑肌肌條頻率增強率變化

2.2 模型鑒定實驗結(jié)果

2.2.1 癥狀及體征檢測 觀察整個造模階段大鼠的體征變化，模型組大鼠在碘乙酰胺灌胃期間，乳鼠長有微絨毛，但沒有被毛，體征沒有明顯的變化。分籠后模型組大鼠的皮毛都較順滑光澤，精神狀態(tài)良好，糞便呈橢球形且干稀適中，與正常組無異。小平臺站立期間模型組大鼠，皮毛略粗糙，精神狀態(tài)不佳，到處亂竄，比較難抓持，警覺性高，回到籠子里后蜷縮在一起，大便干燥。正常組大鼠精神狀態(tài)良好，大便正常。

2.2.2 曠場試驗檢測 通過錄像視頻的觀察計算大鼠的穿個次數(shù)和站立次數(shù)。見表2。

表2 大鼠曠場實驗運動情況的比較（，n =5）

表2 大鼠曠場實驗運動情況的比較（，n =5）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.2.3 糖水試驗檢測 見圖3。

圖3 大鼠糖水消耗百分比

2.3 功能性消化不良大鼠胃組織RhoA 及ROCK 的mRNA 表達比較 見圖4。

圖4 RhoA 及ROCK 的mRNA 水平表達

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，胃腸動力障礙、容受性舒張破壞、內(nèi)臟高敏感、胃腸激素、精神狀態(tài)等與功能性消化不良有關(guān)[6]。四磨湯源于《重訂嚴(yán)氏濟生方》[7]，由木香、枳殼、烏藥、檳榔四味組成?！侗静菥V目》記載：木香乃三焦氣分之藥，能升降諸氣；枳殼長于行氣寬中除脹，消積導(dǎo)滯，破堅消脹，開痰逐水，通便；烏藥辛散溫通，通理上下諸氣，順氣降逆，有散寒行氣兼以溫腎之功；檳榔破堅宣壅，消食通腸，行氣導(dǎo)滯以除腹?jié)M。四磨湯在臨床上常用于治療FD 胃動力障礙[8]。對其關(guān)于胃竇平滑肌收縮與鈣離子通道研究報道較多[9]，但與鈣敏化機制關(guān)系研究較少。鈣敏化機制為非鈣依賴性機制，對平滑肌收縮的維持起到重要的調(diào)節(jié)作用。鈣敏化機制是通過使磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化增強，增加對鈣離子的敏感性，進一步增強使平滑肌的收縮[10]。鈣敏化機制主要是通過RhoA 及其下游效應(yīng)分子ROCK 介導(dǎo)[11]。Rho是一種小分子 G 蛋白，是 Ras 蛋白超家族成員之一；ROCK 是Rho 激酶，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要有ROCK1 和 ROCK2 兩種亞型。RhoA/ROCK 對胃平滑肌收縮發(fā)揮重要作用。

Y27632 是RhoA/ROCK 信號通路抑制劑[12]，本研究中使用四磨湯和Y27632 作用胃竇及胃底肌條，發(fā)現(xiàn)四磨湯對胃竇及胃底平滑肌的作用是否與RhoA/ROCK 信號通路有關(guān)。四磨湯作用平滑肌肌條后，胃竇及胃底平滑肌收縮的作用增強。當(dāng)四磨湯和Y27632共同作用平滑肌肌條，四磨湯對胃竇及胃底平滑肌肌條收縮的頻率較處理前明顯降低，提示四磨湯可能通過RhoA/ROCK 信號通路干預(yù)功能性消化不良胃動力障礙。采用碘乙酰胺灌胃，孤養(yǎng)和小平臺復(fù)合因素造模建功能性消化不良大鼠模型。通過大鼠狀態(tài)、曠場試驗和糖水試驗，驗證大鼠功能性消化不良模型。通過分子生物學(xué)方法檢測模型及四磨湯干預(yù)大鼠的胃組織RhoA 及ROCK 的mRNA 水平表達。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠組的RhoA 及ROCK 蛋白mRNA 表達下降。四磨湯干預(yù)后，RhoA 及ROCK 蛋白mRNA 表達上升。提示四磨湯與功能性消化不良胃RhoA/ROCK有一定的相關(guān)性。

綜上所述，四磨湯與胃組織RhoA/ROCK 表達相關(guān)，且四磨湯對功能性消化不良的改善作用可能與RhoA/ROCK 相關(guān)。