◎ 楊燕紅，賓雁林，趙大洲，丘鷹昆

（1.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 本溪 117000；2.廈門大學(xué) 藥學(xué)院，福建 廈門 361105；3.一陽生生物科技有限公司，福建 廈門 361118）

小球藻（Chlorella cvulgaris）為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂類等。目前研究發(fā)現(xiàn)，小球藻的蛋白具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3-5]、降脂[6]等作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，小球藻蛋白粗提液對(duì)胰脂肪酶（Pancrelipase，PL）活性有抑制作用[6]，而胰脂肪酶[7]是脂肪消化吸收的關(guān)鍵酶，抑制其活性可以有效地降低人體對(duì)脂肪的消化吸收。目前臨床上普遍使用的胰脂酶抑制劑[7]藥物是奧利司他，但該成分存在一些不良反應(yīng)，如肝損傷、營(yíng)養(yǎng)不良、脂肪性大便等胃腸道反應(yīng)。因此，尋找天然產(chǎn)物中胰脂肪酶抑制劑并完善其制備方法十分重要。小球藻具有抑制胰脂肪酶活性的作用。為此，本文通過多種蛋白酶水解法獲得具有較高抑制胰脂肪酶活性的小球藻多肽。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

小球藻干粉（上海光語生物科技有限公司）；奧利司他（浙江海正藥業(yè)）；風(fēng)味蛋白酶、2709堿性蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；537酸性蛋白酶、氨基肽酶（滄州夏盛生物技術(shù)有限公司）；復(fù)合蛋白、1398中性蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司）；超純水（廈門大學(xué)藥學(xué)院提供）；乙醇（色譜 純，F(xiàn)airfleld，CT）；Tris（Sigma公 司）；pNPB（Sigma公司）；DMSO（西隴科學(xué)股份有限公司）；Toyopearl尺寸排阻填料HW-40F（北京英萊克科技發(fā)展有限公司）；硅藻土（石家莊天旭環(huán)保科技有限公司）。

1.2 儀器

球磨機(jī)（上海英用機(jī)械有限公司）；離心機(jī)（德國(guó)進(jìn)口）；酶標(biāo)儀（IMARK，美國(guó)伯樂進(jìn)口）；水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；電子天平（CP114METTLER TOLEDO，奧豪斯儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-5200V，昆山市超聲儀器有效公司）。

1.3 小球藻多肽制備方法

1.3.1 破壁提取

準(zhǔn)確稱取小球藻粉500 g；超純水5 L，常溫下攪拌均勻后送入球磨機(jī)均質(zhì)30 min，然后將小球藻粉懸濁液置于帶冷卻功能的超聲波提取器中，溫度設(shè)置為2～6 ℃，在580 W的超聲功率下超聲20 min，得到粗提液。

1.3.2 離心除雜

將粗提液于4 ℃，轉(zhuǎn)速為8 000 r·min-1條件下離心30 min，并過濾，之后取上清液檢測(cè)其蛋白質(zhì)濃度，后濃縮至蛋白質(zhì)含量為2%，得到小球藻水提物。

1.3.3 酶解

將上述所得的小球藻水提物按照表1各酶的水解條件進(jìn)行酶解處理，經(jīng)過85 ℃水浴15 min滅酶操作以終止水解反應(yīng)，室溫冷卻后將水解液經(jīng)硅藻土過濾，取過濾液經(jīng)減壓濃縮得到酶解產(chǎn)物，減壓濃縮的參數(shù)為真空度0.08～0.10 MPa，濃縮溫度40～60 ℃，濃縮時(shí)間2 h[6,8-10]。

表1 不同酶的水解條件表

1.3.4 脂肪酶抑制劑活性評(píng)價(jià)方法

采用對(duì)硝基苯酚法[11-12]測(cè)定各組分脂肪酶活抑制率。①PL工作液：準(zhǔn)確稱取25 mg PL加5 mL Tris緩沖液，振搖15 min后在18 ℃下離心10 min。②配制底物4-硝基苯丁酸酯（4-nitrophenyl butyrate，pNPB）溶液：量取17.5 μL pNPB，用乙腈定容至10 mL。③稱 取7.57 g Tris，3.65 g NaCl和19.4 mg CaCl2加適量水溶解，用鹽酸調(diào)pH至7.4，室溫冷卻，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，4 ℃保存。然后在96孔板中加入175 μL Tris緩沖液（0.25 mol·L-1Tris緩 沖 液，含0.25 mol·L-1NaCl和0.7 mmol·L-1CaCl2，pH=7.4）、20 μL PL工作液、4 μL樣品后，37 ℃中孵育5 min，然后加入1 μL pNPB溶液，2.5 min后使用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處的OD值，平行3次；奧利司他（Orlistat）代替樣品作為陽性對(duì)照，DMSO代替樣品作為不加抑制劑組；抑制率=（AE-AT）/AE×100%，其中，AT為加抑制劑組的OD值，AE為不加抑制劑組的OD值。

1.3.5 活性多肽純化

將1398中性蛋白酶酶解產(chǎn)物用Toyopearl HW-40F進(jìn)行尺寸排阻色譜分離純化，按出峰情況收集各分離組分，上樣量為500 mg。色譜條件為超純水（A）-乙醇（B）先等度洗脫，0～2 h，100%A；然后梯度洗脫，2～3 h，0～100%B；再等度洗脫，3～4 h 100%B；流速1 mL·min-1，每6 min收集一管，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。收集并合并相同色譜峰，得到11個(gè)餾分，分別命名為A1～A11，并進(jìn)行下一步活性篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶水解產(chǎn)物脂肪酶抑制率比較

將按照1.3.3酶解條件得到的酶解產(chǎn)物配制成4 mg·mL-1，并分別進(jìn)行脂肪酶抑制活性篩選，且與陽性藥奧利司他（Orlistat）進(jìn)行對(duì)比，各酶解產(chǎn)物對(duì)脂肪酶活性的抑制率如表2所示。由表2可知，1398中性蛋白酶的酶解產(chǎn)物具有較好的脂肪酶抑制活性，其余酶解產(chǎn)物則對(duì)脂肪酶活性無抑制作用或抑制程度較低。

2.2 中性蛋白酶解產(chǎn)物活性部位確定

A1～A11各組分色譜圖如圖1所示。該部分經(jīng)減壓濃縮后，通過MALDI-TOF MS測(cè)定各組分多肽分子量[13]，并鑒定各組分對(duì)脂肪酶的抑制活性，其中脂肪酶活抑制率測(cè)試結(jié)果如表3所示。

表2 脂肪酶抑制活性篩選表

圖1 A1～A11餾分色譜圖

表3 組分A1～A11脂肪酶活抑制率表

由表3可知，A7的抑制率最高，達(dá)24.27%，進(jìn)一步對(duì)該提取物進(jìn)行梯度活性實(shí)驗(yàn)篩選，測(cè)定其IC50值為（8.25±0.07） mg·mL-1。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

由不同酶篩選得到的小球藻多肽對(duì)于脂肪酶抑制率不同，其中采用1398中性蛋白酶所制得的小球藻多肽具有更高脂肪酶抑制活性，進(jìn)一步對(duì)該多肽進(jìn)行尺寸排阻色譜分離，發(fā)現(xiàn)不同部位活性不同，組分A7活性最高，其他組分對(duì)脂肪酶無抑制活性或抑制活性較弱。

3.2 討論

本研究通過不同酶篩選得到的小球藻多肽對(duì)脂肪酶抑制率不同。其中，中性蛋白酶水解法得到的小球藻多肽，分子量為600～700 Da的多肽對(duì)脂肪酶抑制效果良好，這可能與不同酶水解得到的多肽片段的種類、結(jié)構(gòu)以及所暴露的活性位點(diǎn)不同有關(guān)，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)研究。本文將小球藻以上述方式用1398中性蛋白酶水解，運(yùn)用尺寸排阻色譜分離，收集分子量具有較高脂肪酶抑制活性部分，以此快速獲得具有較高脂肪酶抑制活性的小球藻多肽，該方法制得的小球藻多肽具有開發(fā)降脂活性功能產(chǎn)品的前景。