◎ 王 迪，賓雁林，趙大洲，丘鷹昆

（1.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 本溪 117000 2.廈門大學(xué) 藥學(xué)院，福建 廈門 361105；3.一陽生生物科技有限公司，福建 廈門 361118）

螺旋藻又名藍細菌，是一種古老的絲狀藍藻[1]，富含藻藍蛋白[2]、螺旋藻多酚、小分子多糖[3]等活性成分。研究表明，螺旋藻提取物具有抗氧化[4-5]、抗腫瘤[6-7]、抗癌[8]、降血壓[9]等功效。螺旋藻廣泛用于食品、飼料和醫(yī)藥等領(lǐng)域，提取物在護膚品中有較為廣泛的應(yīng)用，其改善皮膚暗沉、曬黑、色素紊亂等方面的功效受到較多關(guān)注[10]。

酪氨酸酶是一種活性中心含有Cu2+的多功能氧化酶[11]，酪氨酸酶抑制劑通過抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成，可用來預(yù)防和治療色素沉著和黑色素瘤[12]等。研究發(fā)現(xiàn)，在螺旋藻中提取得到了可以用于抑制酪氨酸酶活性的物質(zhì)，但活性部位尚不明確[13]。本文提供一種具有酪氨酸酶抑制活性的螺旋藻多肽的制備方法，即將螺旋藻粉與純化水混勻得到的螺旋藻混懸液依次經(jīng)破壁提取、離心靜置除雜、酶解及分離純化得到螺旋藻多肽，對螺旋藻多肽進行酪氨酸酶抑制活性篩選，結(jié)果顯示以雙酶法[14]得到的酶解產(chǎn)物具有較好的酪氨酸酶抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料

螺旋藻粉（西安西海生物科技有限公司）；硅藻土（石家莊天旭環(huán)?？萍加邢薰荆?；Toyopearl尺寸排阻填料HW-40F（北京英萊克科技發(fā)展有限公司）；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；2709堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；1398中性蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司）；537酸性蛋白酶、氨基肽酶（滄州夏盛生物技術(shù)有限公司）；酪氨酸酶（上海源葉生物科技有限公司）；曲酸（北京伊諾凱科技有限公司）； 磷酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；左旋多巴L-DA（北京伊諾凱科技有限公司）；乙醇（色譜純，F(xiàn)airfleld，CT，美國）；超純水（廈門大學(xué)藥學(xué)院提供）。

1.2 儀器

電子天平（CP114 METTLER TOLEDO，奧豪斯儀器有限公司）；冷凍干燥機（Christ Alpha 2-4，杭州富睿捷科技有限公司）；基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF/ TOF MS 5800，美國進口）；球磨機（上海英用機械有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-5200V，昆山市超聲儀器有限公司）；超速離心機（德國進口）；酶標儀（IMARK，美國伯樂進口）；水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 螺旋藻多肽的制備方法

將螺旋藻粉與超純水混勻得到的螺旋藻混懸液依次經(jīng)破壁提取、離心靜置、過濾除雜、酶解及分離純化得到螺旋藻多肽。

1.3.2 破壁提取

準確稱取500 g螺旋藻粉，加入5 000 mL超純水混合，常溫下磁力攪拌均勻后送入球磨機均質(zhì)30 min，然后將螺旋藻粉溶液至于帶冷卻功能的超聲波提取器中，溫度設(shè)置2～6 ℃，在580 W的超聲功率下超聲20 min，得到螺旋藻粗提液。

1.3.3 離心與除雜

將螺旋藻粗提液于4 ℃，轉(zhuǎn)速為8 000 r·min-1條件下離心30 min并過濾，取上清液，濃縮、冷凍干燥，得到螺旋藻蛋白凍干粉。

1.3.4 酶解

將上述得到的螺旋藻水提液按照表1中相應(yīng)酶的水解條件進行酶解處理，酶解結(jié)束后，在85 ℃下滅酶活15 min，用適量硅藻土過濾，取上清液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到相應(yīng)酶解產(chǎn)物。雙酶水解法指按照表1中的參數(shù)先用2709堿性蛋白酶水解，所得產(chǎn)物進一步用木瓜蛋白酶水解，滅酶活，用適量硅藻土過濾，取上清液，減壓濃縮，冷凍干燥，得雙酶解產(chǎn)物。

表1 不同酶處理螺旋藻的條件表

1.3.5 酪氨酸酶抑制活性評價方法

酪氨酸酶活性測定方法根據(jù)樓彩霞等[15]描述的方法加以修改，即將20 μL 0.5 mmol·L-1的L-DOPA置于試管中，以其為底物，分別加入不同濃度的不同酶解產(chǎn)物40 μL，在37 ℃恒溫水浴鍋中各自保溫10 min，加入40 μL 40 μg·mL-1的酪氨酸酶水溶液于37 ℃恒溫水浴鍋中各自保溫10 min。由于形成多巴素，在475 nm波長處黑色素有最大吸收峰，故使用酶標儀測定OD475，實驗平行3次，取其平均值。以曲酸[16]為陽性對照，以pH=6.8的磷酸緩沖溶液為空白對照，根據(jù)抑制物質(zhì)量濃度-酶抑制率回歸方程求得半抑制濃度（IC50）。抑制率計算公式為

式中：AT為加抑制劑組的OD值；AE為不加抑制劑組的OD值。

1.3.6 活性多肽的純化

對雙酶法獲得的螺旋藻多肽用Toyopearl HW-40F進行尺寸排阻色譜分離，分離條件如下。層析柱體積：130 mL；上樣量：25 mg·mL-1；流動相：水（A）/乙醇（B）；洗脫程序：0～90 min，0% B→0% B；90～120 min，0% B→100% B；120～180 min，100% B→100% B；流速：1 mL·min-1，檢測波長：214 nm、260 nm、280 nm、405 nm。每6 min收集一管，共收集35 管。收集、合并相同色譜峰，得到A1～A44個組分，進一步進行活性篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶解產(chǎn)物的酪氨酸酶抑制活性比較

將得到的酶解產(chǎn)物配制成4 mg·mL-1的溶液，分別進行酪氨酸酶抑制活性篩選，并與陽性藥曲酸[16]進行對比，各酶解產(chǎn)物對酪氨酸酶活性的抑制率如表2所示。由表2可知，分別用2709堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶對螺旋藻提取物進行水解時，酶解產(chǎn)物有一定的酪氨酸酶抑制活性，其他酶不具有活性。進一步用具有酪氨酸抑制活性的兩個酶對螺旋藻提取物進行雙酶水解，發(fā)現(xiàn)所得到的螺旋藻多肽抑制率進一步增強，為21.82%。

表2 不同酶解產(chǎn)物的酪氨酸酶抑制率表

2.2 雙酶解產(chǎn)物的活性部位確認

經(jīng)測定，產(chǎn)物在檢測波長280 nm時吸光值最為靈敏，按280 nm檢測結(jié)果收集分離產(chǎn)物為4部分,分別命名為A1～A4，減壓濃縮，根據(jù)譚和平等[17]所提供的蛋白質(zhì)分子量測試方法對A1～A4進行測定，并檢測各純化產(chǎn)物抑制酪氨酸酶的活性，結(jié)果如表3所示。由表3可知，利用雙酶法處理所得到的螺旋藻多肽的4個組分均有酪氨酸酶抑制活性，其中純化組分A4的抑制率最高，為39.04%，進一步對該組分進行分子梯度活性實驗，求得IC50值為（5.76±0.06） mg·mL-1。

表3 多肽分離液A1～A4的酪氨酸抑制率結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

單一水解螺旋藻提取物時，木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物具有微弱的酪氨酸酶抑制活性，其余酶解產(chǎn)物則無酪氨酸酶抑制活性；而采用先加入堿性蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶進行雙酶法得到的螺旋藻多肽能夠顯著提高酪氨酸酶抑制活性，進一步對雙酶解多肽進行尺寸排阻色譜分離，發(fā)現(xiàn)4個組分均有酪氨酸酶抑制活性。

3.2 討論

采用雙酶法制備的螺旋藻多肽具有更好的酪氨酸酶抑制活性。孫宜君等[14]通過雙酶法制備螺旋藻多肽的工藝研究推論第二種酶可以利用前一種酶水解后的產(chǎn)物為底物進行二次水解。利用這種酶解方法，可以提高多肽產(chǎn)率，從而達到增強酪氨酸酶抑制活性的作用。

本文所提供的螺旋藻多肽制備方法具有多種優(yōu)勢，依次通過堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶進行雙水解得到的螺旋藻多肽對酪氨酸酶抑制活性高，具有抑制黑色素形成的作用，在預(yù)防、治療色素障礙性皮膚病，研究化妝品美白劑等方面具有良好的發(fā)展前景；同時，為螺旋藻多肽的進一步開發(fā)利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。