◎ 余宗盛，黎新江，陳小娟，杜玉蘭，李曉敏，栗原博，毛新亮

（1.完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528400；2.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山 528400）

骨關(guān)節(jié)健康養(yǎng)護(hù)的功能食品興起于歐美市場(chǎng)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)則在近幾年興起。骨關(guān)節(jié)健康重點(diǎn)關(guān)注的是預(yù)防和改善骨性關(guān)節(jié)炎。在中國(guó)，雙膝骨關(guān)節(jié)炎患病率達(dá)15.6%，并以中老年患者居多，骨性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。研究表明，骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病與年齡、性別、肥胖、運(yùn)動(dòng)損傷、自身免疫以及炎癥代謝等因素密切相關(guān)，主要病理表現(xiàn)為軟骨基質(zhì)的持續(xù)降解[1]。軟骨基質(zhì)主要包括大分子多糖類物質(zhì)、膠原蛋白、水分以及無(wú)機(jī)鹽，其中膠原蛋白中以Ⅱ型膠原蛋為主，Ⅱ型膠原蛋白具有維持軟骨組織結(jié)構(gòu)完整性、刺激軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)分化、提升關(guān)節(jié)性能和促進(jìn)骨形成的作用[2-4]。除抗炎止痛外，補(bǔ)充含膠原蛋白的功能性食品是緩解軟骨流失與促進(jìn)軟骨再生的重要預(yù)防和改善措施。研究表明，軟骨膠原蛋白肽可與非變性II型膠原蛋白協(xié)同預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎[5]。中藥尤其是藥食兩用的藥材是否對(duì)膠原蛋白具有增效作用則鮮有報(bào)道。因此，本研究采用地塞米松誘導(dǎo)的斑馬魚軟骨損傷模型，探索姜黃與雪蓮培養(yǎng)物對(duì)膠原蛋白保護(hù)軟骨組織的協(xié)同增效作用，并采用膠原蛋白和藥食兩用的普通食品原料組合開發(fā)一款功能性食品，為預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎和改善關(guān)節(jié)健康提供一種新途徑，減少藥物治療的成本。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，日本），顯微鏡相機(jī)（VertA1），精密電子天平（CP214，OHAUS，美國(guó)），熒光顯微鏡（AZ100，Nikon，日本）。

姜黃（BCW-050 1712/B-11，上海誠(chéng)一食品），雪蓮培養(yǎng)物（H181001，大連普瑞康生物），非變性II型膠原蛋白（20170902F，海南盛美諾生物），水解II型膠原蛋白（20181125D，海南盛美諾生物），硫酸軟骨素A鈉鹽（6815，上海阿拉?。?，乙酸地塞米松（LT80O93，北京百靈威科技），甲基纖維素（Sigma，美國(guó)）。

基于本研究制成的完美牌臻固力固體飲料（批次：20 190620；規(guī)格：1 g/袋），完美（廣東）日用品有限公司生產(chǎn)。

1.2 斑馬魚與供試品處理

2日齡的Tg（col2a1a:EGFP）轉(zhuǎn)基因軟骨熒光斑馬魚以自然成對(duì)交配繁殖方式獲得，飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS·cm-1；pH為6.9 ～7.2；硬度為53.7～71.6 mg·L-1CaCO3）。所有飼養(yǎng)管理過(guò)程均符合國(guó)際AAALAC認(rèn)證要求。

隨機(jī)選取270尾斑馬魚分為正常組、模型組、硫酸軟骨素陽(yáng)性組（1 000 μg·mL-1）、姜黃組（0.997 μg·mL-1）、雪蓮培養(yǎng)物組（0.997 μg·mL-1）、膠原蛋白組（60.505 μg·mL-1）、膠原蛋白+姜黃組（61.503 μg·mL-1）、膠 原 蛋 白+雪 蓮 培 養(yǎng) 物 組（61.503 μg·mL-1）和膠原蛋白+姜黃+雪蓮培養(yǎng)物組（62.5 μg·mL-1），每孔30尾，置于六孔板中給藥處理。將地塞米松（25 mmol·L-1）與供試品溶于水中處理斑馬魚，每孔為3 mL，正常組給予等體積的養(yǎng)魚用水。于72 h后采用熒光顯微鏡檢測(cè)斑馬魚的綠色熒光強(qiáng)度。

1.3 檢測(cè)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并保存圖片，用NIS-Elements D 3.10高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算熒光強(qiáng)度（S）。軟骨再生作用計(jì)算為軟骨再生率=(S供試品組-S模型組)/S模型組×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

用GraphPad 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中兩組間比較采用t-test檢驗(yàn)，多組間比較采用oneway ANOVE方差分析（方差齊時(shí)）或Dunnett’st-檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)），p＜0.05表明具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型建立與陽(yáng)性藥硫酸軟骨素對(duì)軟骨再生的影響

如圖1與表1所示，與正常對(duì)照組相比，地塞米松組斑馬魚軟骨的熒光強(qiáng)度顯著降低（p＜0.001），表明模型建立成功。而陽(yáng)性對(duì)照藥硫酸軟骨素（1 000 μg·mL-1）顯著增強(qiáng)了地塞米松處理后軟骨的熒光強(qiáng)度（p＜0.001），其軟骨再生率為66%。由此可見(jiàn)，硫酸軟骨素對(duì)斑馬魚軟骨再生具有明顯的促進(jìn)作用。

2.2 姜黃、雪蓮培養(yǎng)物、膠原蛋白對(duì)損傷軟骨再生的影響

相較于模型組，姜黃（0.997 μg·mL-1）、雪蓮培養(yǎng)物（0.997 μg·mL-1）、膠原蛋白（60.505 μg·mL-1）均能不同程度地增強(qiáng)軟骨的熒光強(qiáng)度（圖1與表1）。姜黃對(duì)軟骨的促進(jìn)作用較弱，無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。而雪蓮培養(yǎng)物與膠原蛋白顯著促進(jìn)了軟骨的修復(fù)（p＜0.001），軟骨再生率分別為48%和73%（表1）。表明姜黃、雪蓮培養(yǎng)物、膠原蛋白對(duì)損傷軟骨再生均有促進(jìn)作用，且膠原蛋白＞雪蓮培養(yǎng)物＞姜黃。

2.3 姜黃、雪蓮培養(yǎng)物和膠原蛋白復(fù)配對(duì)損傷軟骨再生促進(jìn)的影響

姜黃與雪蓮培養(yǎng)物分別與膠原蛋白進(jìn)行復(fù)配時(shí)（61.503 μg·mL-1），對(duì)膠原蛋白的軟骨保護(hù)作用產(chǎn)生了一定的拮抗作用，使其軟骨再生率從73%下降為63%和64%。而姜黃、雪蓮培養(yǎng)物與膠原蛋白三者復(fù)配物（62.500 μg·mL-1）的軟骨再生率卻提升至82%（表1）。由此可見(jiàn)，單獨(dú)使用姜黃或雪蓮培養(yǎng)物復(fù)配膠原蛋白時(shí)，會(huì)使膠原蛋白促進(jìn)損傷軟骨再生效果下降，發(fā)生拮抗作用；而兩者同時(shí)復(fù)配可產(chǎn)生協(xié)同增效作用，增強(qiáng)膠原蛋白的功效。

表1 各組斑馬魚的軟骨EGFP熒光強(qiáng)度與軟骨再生率表

3 功能性食品改善膝骨關(guān)節(jié)炎的有效率研究

基于本研究開發(fā)了一款功能性食品——完美牌臻固力固體飲料，現(xiàn)就其改善膝骨關(guān)節(jié)炎的有效率進(jìn)行調(diào)查。以填寫《膝骨性關(guān)節(jié)炎程度調(diào)查問(wèn)卷》的方式征集人群，同時(shí)采用年齡≥50歲，晨僵時(shí)間≤30 min，活動(dòng)時(shí)有骨摩擦音，X線片顯示關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化和（或）囊性變、關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)要求綜合選定食用完美牌臻固力固體飲料的對(duì)象，共計(jì)32人。其中6人完全符合4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，19人滿足其中1項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，7人屬于《膝骨性關(guān)節(jié)炎程度調(diào)查問(wèn)卷》中關(guān)節(jié)癥狀評(píng)分排名前7位的人員。

食用完美牌臻固力固體飲料1個(gè)月后，有效樣本25人。參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》，根據(jù)試用前后癥狀積分下降百分率進(jìn)行功能評(píng)價(jià)判斷，功能效果分為顯效（癥狀積分減少≥70%）、有效（30%≤癥狀積分減少＜70%）、無(wú)效（癥狀積分減少＜30%）3個(gè)等級(jí)，計(jì)算公式（尼莫地平法）為（試用前總積分-試用結(jié)束后總積分）/試用前總積分×100%，總有效率=（顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總試用例數(shù)×100%。

調(diào)查結(jié)果顯示，完美牌臻固力固體飲料試用1個(gè)月，按《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》標(biāo)準(zhǔn)，改善膝骨性關(guān)節(jié)炎總有效率為52.0%。

4 結(jié)論

本研究以轉(zhuǎn)基因軟骨熒光斑馬魚為模型，揭示了姜黃、雪蓮培養(yǎng)物、膠原蛋白組合物對(duì)損傷關(guān)節(jié)軟骨再生的促進(jìn)作用。此外，通過(guò)配方實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃、雪蓮培養(yǎng)物兩種中藥單獨(dú)復(fù)配膠原蛋白時(shí)會(huì)降低其損傷軟骨再生促進(jìn)作用；姜黃、雪蓮培養(yǎng)物兩者同時(shí)和膠原蛋白進(jìn)行復(fù)配將協(xié)同增效膠原蛋白的軟骨再生功能。斑馬魚作為一種非哺乳類模式生物，具有胚胎透明、骨骼發(fā)育迅速、與人類基因高度同源等特點(diǎn)，在骨研究領(lǐng)域已逐漸成為重要的藥物篩選模型[6]。在功能食品開發(fā)過(guò)程中，采用斑馬魚作為骨關(guān)節(jié)軟骨損傷改善作用的篩選模型也已發(fā)揮了重要的作用，篩選了姜黃、雪蓮培養(yǎng)物、非變性II型膠原蛋白、水解II型膠原蛋白重要的組合物并以優(yōu)選的組合比例開發(fā)了預(yù)防和改善膝骨關(guān)節(jié)炎的功能性食品，為后續(xù)功能性食品開發(fā)提供了一條可借鑒的研發(fā)思路。