王倩(南京中醫(yī)藥大學(xué)科技實驗中心, 江蘇 南京 210046)

0 引言

液相色譜(LC)是根據(jù)目標(biāo)化合物在色譜柱中保留時間的差異，并將化合物從混合物中分離出來，進(jìn)行收集及檢測的儀器[1-2]。質(zhì)譜(MS)是把分子轉(zhuǎn)化成氣態(tài)離子，并根據(jù)質(zhì)荷比(M/Z : M質(zhì)量數(shù)，Z電荷數(shù))的差異把離子進(jìn)行分離檢測的儀器[3]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)在過去的10～15年里在臨床實驗室取得了巨大的增長。對低分子量分析物，它具有優(yōu)于免疫分析法或傳統(tǒng)的高效/壓力液相色譜(HPLC)的分析特異性，并且比氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)具有更高的通量[4]。為更好地延長儀器壽命、降低耗材成本并維持儀器的良好狀態(tài)，獲得更可靠的分析數(shù)據(jù)，儀器的日常維護(hù)及保養(yǎng)至關(guān)重要。以下以島津公司CTO-30A高效液相色譜與AB SCIEX公司QTRAP 4500質(zhì)譜聯(lián)用為例，從儀器結(jié)構(gòu)特點出發(fā)，結(jié)合日常工作，總結(jié)使用過程中的常見問題及經(jīng)驗進(jìn)行闡述。

1 培訓(xùn)與管理

1.1 儀器預(yù)約與管理

平臺目前采用線上預(yù)約的方式進(jìn)行儀器的培訓(xùn)以及預(yù)約使用申請。HPLC-QTRAP 4500 液質(zhì)聯(lián)用儀是實驗室大型分析儀器，應(yīng)有專業(yè)技術(shù)人員專門管理。通常采用送樣測試的方式進(jìn)行日常的分析測試工作。通常情況下，在預(yù)約測試樣品前，送樣人員應(yīng)與儀器管理者進(jìn)行有效溝通，常見于探討儀器本身是否可以滿足實驗?zāi)康?。確定可行性后就分析測定的化合物性質(zhì)、樣品的前處理方法、色譜柱的選擇、流動相的配制以及耗材的準(zhǔn)備等方面再進(jìn)行進(jìn)一步的方法制定。在預(yù)約規(guī)定的時間，送檢人員將所需測定的樣品提供給儀器管理者進(jìn)行上機(jī)測定，樣品測定完成后，儀器管理員進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，并將檢測結(jié)果用格式化的光盤進(jìn)行存儲并將實驗數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)交給送樣人員。液質(zhì)聯(lián)用儀是大型分析精密儀器，在日常的使用中若因樣品處理不當(dāng)或者操作不當(dāng)，輕則造成儀器污染導(dǎo)致儀器壽命縮短，重則損壞儀器從而花費高額的維修費用。因此，需要儀器管理人員專門進(jìn)行操作。然而，因液質(zhì)聯(lián)用儀應(yīng)用廣泛，日常需測定的樣本量巨大，服務(wù)的人員眾多，儀器管理人員難以做到事無巨細(xì)。因此，平臺每年都會舉辦液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器理論及操作培訓(xùn)，主要以開展講座以及儀器上機(jī)培訓(xùn)為主。包括但不限于介紹儀器的基本原理、儀器在使用過程中遇到的問題及解決方案、數(shù)據(jù)的處理以及結(jié)果的分析等方面。對培訓(xùn)合格以及多次考核均滿足要求者，方可允許其獨立進(jìn)行儀器的操作。獨立使用儀器者必須嚴(yán)格遵守質(zhì)譜儀器實驗室制定的相關(guān)規(guī)章制度，嚴(yán)格按照培訓(xùn)的操作規(guī)程使用儀器。樣本如需要過夜進(jìn)樣時需與儀器管理人員報備。操作者若違反質(zhì)譜實驗室規(guī)定而造成儀器故障并影響性能者，將被取消儀器使用資格。在使用過程中儀器出現(xiàn)任何問題或者故障，儀器使用者應(yīng)及時通知儀器管理員，采取相應(yīng)措施進(jìn)行補(bǔ)救以免對儀器造成更嚴(yán)重的損害。

1.2 樣品前處理

明確樣品類型是送樣人員首先要提供給儀器管理者的信息，針對不同的樣品類型，如生物樣本、藥用植物、食品及化妝品等前處理方法是有區(qū)別的。除此之外，樣品溶液要排除含有生物大分子、無機(jī)酸、難揮發(fā)的鹽、表面活性劑等。此外，樣品只限于甲醇、乙腈、水中的一種或者其組合進(jìn)行樣品溶解，離心后并采用0.22 μm的濾膜過濾(注意：水系膜與有機(jī)系膜選用區(qū)別)，特殊情況下如樣品量較少無法完成濾膜過濾，應(yīng)采用高速離心機(jī)4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min后取上清液進(jìn)行進(jìn)樣分析。確保樣品溶液透明且無沉淀等現(xiàn)象。鑒于質(zhì)譜的靈敏度高，防止因溶劑的雜質(zhì)較多影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。選用溶劑溶解樣品時要注意其純度，如甲醇/乙腈選用包裝明確標(biāo)注為質(zhì)譜級或色譜級溶劑，水要選用一級水。為了防止因樣品濃度過高造成色譜柱殘留或者離子源污染等情況的發(fā)生，樣品的濃度應(yīng)控制在小于1 μg/mL最佳。

2 日常使用與保養(yǎng)

2.1 環(huán)境要求

液質(zhì)聯(lián)用儀器的正常運行對環(huán)境要求較為苛刻，儀器周圍的電磁感應(yīng)裝置會影響液質(zhì)聯(lián)用儀器正常運行。因此需要維持環(huán)境溫度在20～24 ℃，濕度保持在35%～50%。一般日常室溫與最后一次校正時相差4 ℃以內(nèi)。并且需要保證溫度的變化率小于2 ℃/h。若環(huán)境溫度變化率過大，會造成質(zhì)譜儀質(zhì)量軸偏移，分析測定結(jié)果不準(zhǔn)確。另外，質(zhì)譜儀房間一定要妥善保持通風(fēng)，實驗室良好的通風(fēng)環(huán)境用以控制有機(jī)試劑等有毒有害物質(zhì)排放，保證儀器正常運行。除此之外，實驗室日常要進(jìn)行除塵工作，防止房間灰塵過多造成質(zhì)譜儀電路板短路等情況的發(fā)生。

2.2 液相色譜系統(tǒng)

2.2.1 流動相

液相色譜系統(tǒng)作為質(zhì)譜的進(jìn)樣系統(tǒng)有著不可忽視的作用。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用時，流動相的選擇至關(guān)重要。盡量選用質(zhì)譜(MS)級別的甲醇/乙腈作為有機(jī)相，若流動相為色譜(HPLC)級，應(yīng)采用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾后使用。嚴(yán)禁采用分析級及更低純度的甲醇/乙腈作為流動相，流動相中嚴(yán)禁含有難揮發(fā)的鹽類，如磷酸鹽、硼酸鹽等；流動相中嚴(yán)禁使用含有抑制化合物電離的表面活性劑；嚴(yán)禁使用鹽酸、硫酸等無機(jī)酸。配備完成的流動相應(yīng)先進(jìn)行脫氣，一般超聲5 min左右就可以完成脫氣的目的。一般水相做到現(xiàn)配現(xiàn)用，有機(jī)相可保存1個月左右。若流動相含有鹽類，在每次實驗結(jié)束后應(yīng)先采用高比例的純水進(jìn)行沖洗，然后逐漸升高有機(jī)相比例，此操作的目的是將殘存的鹽類排出，避免腐蝕管路系統(tǒng)。

2.2.2 色譜柱

液質(zhì)聯(lián)用儀與單獨的液相色譜儀相比，顯著的區(qū)別在于配備的色譜柱較短以及流速的相對較低。以便樣品在進(jìn)入離子源時能夠完成很好的電離。因此，在實驗開始前應(yīng)根據(jù)所測化合物的性質(zhì)選擇合適的色譜柱，包括色譜柱長度、粒徑大小、填料種類、pH值范圍、所耐受的壓力以及其與后方質(zhì)譜的兼容性等問題。

對新購買的色譜柱，首次使用前應(yīng)進(jìn)行活化，以常用的普通反相C18色譜柱為例，一般采用0.5 mL/min的甲醇進(jìn)行沖洗大約120 min，然后更換流動相進(jìn)行平衡操作。建議實驗開始前及實驗結(jié)束后都應(yīng)進(jìn)行色譜柱的沖洗，一般先用高比例純水，約90%的純水/甲醇體系進(jìn)行色譜柱的沖洗，然后逐漸提高有機(jī)相比例，最后色譜柱保存在純甲醇中。注意沖洗色譜柱時應(yīng)斷開與質(zhì)譜的管路連接，防止將污染物沖進(jìn)離子源導(dǎo)致離子源污染。在色譜柱沖洗完成后，用二通替換色譜柱，然后用50%甲醇/水以1 mL/min流速沖洗質(zhì)譜儀約30 min左右。若長時間不使用此色譜柱，為防止甲醇揮發(fā)，造成色譜柱的柱效下降，應(yīng)將其保存在高比例有機(jī)相，如90%甲醇/水體系中為宜。

2.3 三重四極桿質(zhì)譜

2.3.1 離子源

質(zhì)譜在工作過程中為了減少高速電子和離子與其他分子之間碰撞導(dǎo)致的能量消耗，離子必須處于高真空狀態(tài)。因此維持離子源及質(zhì)量分析器的高真空度是保證質(zhì)譜儀能夠正常運行的必要條件。機(jī)械泵的狀態(tài)直接關(guān)系到離子源的真空度能否達(dá)到既定要求。因此，應(yīng)注意觀察機(jī)械泵的泵油顏色是否變深，泵油的體積是否控制在距離刻度線約三分之二處。每隔三年或者泵油顏色變深變暗時更換泵油為宜。應(yīng)每日進(jìn)行離子源流路清洗。每周進(jìn)行離子源內(nèi)腔清洗以及機(jī)械泵油量檢查。每月進(jìn)行一次機(jī)械泵濾網(wǎng)清潔，每年進(jìn)行一次儀器除塵工作。除此之外，當(dāng)噴霧針堵塞時應(yīng)及時更換，當(dāng)儀器靈敏度或者分辨率下降時應(yīng)進(jìn)行離子參數(shù)的優(yōu)化。

2.3.2 質(zhì)量分析器

四極桿質(zhì)量分析器是由四根平行的金屬桿組成，四極上加的直流電壓和射頻電壓比值通常是一個常數(shù)，代表儀器的分辨率[5]。四極桿質(zhì)量分析器的靈敏度和分辨率也存在反比例關(guān)系，即提高分辨率的同時會降低其靈敏度[6]。當(dāng)儀器在正常工作時只要改變直流電壓和射頻電壓值而不改變其比值，就能實現(xiàn)不同質(zhì)核比的離子檢測。當(dāng)儀器長時間工作或者進(jìn)行多種分析化合物測定后，通常會導(dǎo)致質(zhì)量數(shù)或多或少的偏差，造成質(zhì)譜儀靈敏度下降，因此，應(yīng)定期進(jìn)行儀器的校正，防止質(zhì)譜質(zhì)量軸偏差，造成測試結(jié)果的不準(zhǔn)確。

3 常見故障排查

3.1 色譜圖異常

一般情況如泵引起的脈沖或者梯度洗脫可能造成色譜圖背景高，此時需要優(yōu)化梯度洗脫條件。除此之外流動相污染時可觀察到背景隨著流動相梯度變化而變化，有時還會“出峰”，此時需要更換流動相，改用級別更高的溶劑。當(dāng)離子源污染時，可觀察到背景信號穩(wěn)定，基本上不隨流動相梯度變化處理，此時需要清洗離子源，包括內(nèi)腔、噴霧針尖端。當(dāng)前幾個情況都處理過后，可嘗試更換管路或/和噴霧針等。當(dāng)交叉污染發(fā)生時，可觀察到色譜圖空白也出峰，一般為進(jìn)樣器污染。需要更換合適的樣品清洗液，此清洗液應(yīng)能溶解樣品并將其從進(jìn)樣針上洗掉。然后進(jìn)行進(jìn)樣針及進(jìn)樣針座的清洗。

3.2 系統(tǒng)壓力異常

當(dāng)系統(tǒng)壓力波動，呈“鋸齒”狀?？赡苁侨軇┪疵摎?，系統(tǒng)引入了氣泡。需將流動相進(jìn)行脫氣，并排清儀器體系中的氣泡。除此之外，泵密封圈的老化也會造成系統(tǒng)壓力的波動。當(dāng)系統(tǒng)壓力偏低，此時需逐一排查如溶劑進(jìn)口過濾芯是否被堵、色譜柱兩端是否擰緊、色譜柱固定相是否流失、與質(zhì)譜連接處管路是否漏液。當(dāng)系統(tǒng)壓力偏高，此時需檢查系統(tǒng)中是否存在不溶性顆粒。將色譜柱拆下?lián)Q上二通后觀察壓力是否正常。若壓力值在正常范圍內(nèi)，則考慮為色譜柱堵塞。將色譜柱進(jìn)行沖洗，完成后重新安裝測試，若壓力值較之前差別過大，則需更換色譜柱。將色譜柱拆下?lián)Q上二通后觀察壓力若仍然偏高，則考慮進(jìn)樣針堵塞可能性較大?？蓪⑦M(jìn)樣針切換至旁路，此時壓力若明顯下降，需要拆下進(jìn)樣針，用50%異丙醇浸泡超聲清洗。

3.3 儀器污染處理

3.3.1 流動相污染

一般流動相的污染，特別是水相較容易污染，長時間放置會出現(xiàn)發(fā)霉長菌的情況，因此水相要選用一級水且現(xiàn)配現(xiàn)用。當(dāng)流動相污染時，首先觀察到的是信號采集時的背景較高，也就是基線較高。需要更換干凈的流動相，或者是更換更高級別的流動相，一般有機(jī)相推薦質(zhì)譜級、色譜級的有機(jī)相需用0.22 μm的濾膜過濾后使用。

3.3.2 色譜柱污染

當(dāng)儀器檢測空白樣品時基線過高，并且有響應(yīng)較高的色譜峰出現(xiàn)時，排除了流動相污染的情況下，色譜柱的污染可能性很高。當(dāng)在檢測過程中樣本量過大或者樣本濃度過高都會導(dǎo)致化合物在色譜柱中殘留。如果流動相用到鹽類，則需要先用10%的甲醇/水低流速進(jìn)行沖洗，然后再換高比例甲醇過夜進(jìn)行沖洗。否則可直接選擇用高比例甲醇低流速過夜沖洗。

3.3.3 離子源污染

當(dāng)檢測的化合物濃度過高或者樣本量過大都會導(dǎo)致離子源污染。質(zhì)譜的工作時間過長會導(dǎo)致非帶電殘留物污染離子源，這些污染物很難通過離子源的高速電磁場，也不能進(jìn)入真空系統(tǒng)。離子源被污染形成的靜電涂層會引起電壓響應(yīng)行為的改變，因此儀器的靈敏度會降低。為預(yù)防質(zhì)譜噪聲高、信號不穩(wěn)定，應(yīng)每周進(jìn)行一次離子源內(nèi)腔，噴霧頭與噴霧針尖端的清洗。一般先在軟件中將質(zhì)譜儀設(shè)置成待機(jī)模式，然后取下離子源，水平取出氣簾板(curtain plate)，用無塵紙蘸取50%甲醇/水擦拭內(nèi)外表面，氮氣吹干。然后用甲醇濕潤的無塵紙沿一個方向擦拭錐孔板(orifice plate)外表面(需關(guān)機(jī))。一張紙擦拭一次，擦拭三次，擦拭完后注意檢查錐孔中是否有纖維殘留。根據(jù)質(zhì)譜的運行時間和樣品量種類，1～2周用50%甲醇/水擦拭離子源部腔體可降低數(shù)據(jù)圖譜背景信號。在沒有氣簾氣(curtian gas)輸入時，為了防止儀器吸入室內(nèi)空氣污染內(nèi)部離子傳輸元件，質(zhì)譜主機(jī)最好關(guān)機(jī)，質(zhì)譜關(guān)機(jī)時，保持氮氣供應(yīng)，可以防止離子軌道受潮。

4 結(jié)語

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是用于檢測分析的重要手段。液質(zhì)聯(lián)用儀器是屬于貴重精密儀器設(shè)備。目前已面向南京中醫(yī)藥大學(xué)全體師生開放，在日常的管理過程中，為避免出現(xiàn)儀器的損毀，保證儀器高效公平的為全校師生的教學(xué)科研提供服務(wù)，需要嚴(yán)格管控儀器的預(yù)約、樣品前處理、色譜柱維護(hù)、離子源及質(zhì)量分析器的保養(yǎng)等工作。建立良好的管理方法，及時進(jìn)行儀器的保養(yǎng)與維護(hù)能夠提高液質(zhì)聯(lián)用儀器使用效率，節(jié)約分析時間，降低耗材成本，能夠得到可靠的分析數(shù)據(jù)。