李丙旭，王姣姣，馬宏躍，周婧

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省中藥藥效與安全性重點實驗室，江蘇 南京 210023）

蟾酥（Bufonis Venenum）之名源于《本草衍義》，屬名貴中藥，為蟾蜍科動物中華大蟾蜍（Bufo gargarizansCantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostitusSchneider）的干燥分泌物。其性溫、味辛，有毒，具有解毒、消腫、止痛、開竅醒神之功效，主要治療癰疽疔瘡、瘰疬、各種疼痛病和神昏吐瀉［1］。目前對蟾酥中的蟾毒靈、沙蟾毒精、酯蟾毒配基等甾烯類成分研究較多，大多根據(jù)其抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等功效開發(fā)產(chǎn)品［2］。但蟾酥在皮膚傷口愈合方面的功效沒有明確報道。鑒于此，作者以蟾蜍甾烯為原料藥制備蟾酥乳膏，并進行外觀及穩(wěn)定性考察，之后通過體外透皮吸收實驗確定蟾酥乳膏劑的體外透皮吸收率。最后將其對皮膚傷口愈合的療效進行初步研究，為后續(xù)的蟾酥產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；D3024R 低溫超高速離心機（美國SCJLOGEX 公司）；BSA124S-CW 電子天平（德國Sartorius公司）；HJ-3恒溫磁力攪拌器（常州國華電器有限公司）；HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）；TK-12D 型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；XW-80A 漩渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

蟾毒靈、酯蟾毒配基、沙蟾毒精、蟾毒他靈、華蟾毒它靈、蟾毒它靈（北京普天同創(chuàng)生物技術(shù)有限公司，批號分別為：118981、110718、180427、180118、180318、180419）；蟾酥（購買于南京）經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)馬宏躍教授鑒定為蟾蜍科動物中華大蟾蜍（Bufo gargarizansCantor）的干燥分泌物；蟾酥二氯甲烷提取物（實驗室自提）；硬脂醇、白凡士林（上海麥克林生化科技有限公司，批號分別為：O815158、V820408）；十二烷基硫酸鈉（上?？蒲派锟萍加邢薰荆枺?250GR500）；丁香油、丙二醇（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為：S24039、S24147）；氮酮（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：A104374）；4-羥基苯甲酸甲酯（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：H0216）；氯化鈉（廣東光華科技股份有限公司，批號：7647-14-5，分析純）；京萬紅軟膏（天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，國藥準字Z12020440）；甲醇（批號：11074107006，色譜純）、乙腈（批號：JA092330，色譜純）（德國Merck公司）。

1.3 動物

豚鼠，雄性，體質(zhì)量250～300 g，普通級，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，許可證號：SCXK（蘇）2017-0011。新西蘭大耳白兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，普通級，雌雄各半，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，許可證號：SCXK（蘇）2016-0008。ICR 小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量20～22 g，SPF 級，購自河南省斯克貝斯生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（豫）2020-0005。豚鼠、兔購入后置于室溫20～25 ℃，相對濕度為40%～60%的飼育室內(nèi)飼養(yǎng)。ICR 小鼠購入后于室溫20 ℃，自然光照條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)。

2 實驗方法

2.1 乳膏制備

參考前期實驗結(jié)果，選取十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺為主要乳化劑［3］，硬脂酸、單甘酯、羊毛脂、硬脂醇和白凡士林為油相。其中硬脂醇還具輔助乳化及穩(wěn)定作用，白凡士林可在皮膚上形成油膜，防止基質(zhì)水分蒸發(fā)，有利于角質(zhì)層水合并具潤滑作用。選用丁香油用于促進蟾酥提取物的溶解及提高蟾酥提取物透皮吸收率；氮酮為促滲劑［4］；4-羥基苯甲酸甲酯為抑菌劑。

乳膏1 制備方法：硬脂酸10%，單甘酯4%，羊毛脂5%，白凡士林2%，氮酮1%，三乙醇胺1%，抑菌劑0.1%（W/W）。取處方中油相成分在75 ℃條件下不斷攪拌至加熱熔化，其余成分溶于純化水加熱至75 ℃，為水相。攪拌條件下將水相加至油相，進行充分乳化。待基質(zhì)乳化完全后，溫度降至45 ℃，將丁香油溶解的蟾酥二氯甲烷提取物加入基質(zhì)中不斷攪拌，使分散均勻。

乳膏2 制備方法：油相（硬脂醇和白凡士林）/水相比例為45/55，十二烷基硫酸鈉1.5%，丁香油5%，氮酮1%，抑菌劑0.1%（W/W）。制備方法同上。

將制備的乳膏進行外觀及穩(wěn)定性考察。外觀考察包括色澤、質(zhì)地、涂布性等；穩(wěn)定性考察包括離心穩(wěn)定性及高溫、低溫、室溫穩(wěn)定性考察。取乳膏劑樣品以4 000 r/min 速度離心30 min，觀察是否有破乳和油水分離現(xiàn)象，同時取樣于55 ℃、-20 ℃、室溫條件下放置24 h，恢復(fù)室溫后觀察是否有破乳和油水分離現(xiàn)象。

2.2 含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：X-Charge C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相：0.2%甲酸-水（A 相），乙腈（B 相）；流速：0.7 mL/min；檢測波長：296 nm；柱溫30 ℃；進樣量：5 μL。梯度洗脫（0～4 min，80%～62% A；4～15 min，62% A；15～25 min，62%～10% A；25～26 min，10%～80%A；26～30 min，80%A）。

2.2.2 對照品溶液的配制

精密稱取蟾毒靈、酯蟾毒配基、沙蟾毒精、蟾毒他靈、華蟾毒它靈、蟾毒它靈對照品各10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解、定容，制成質(zhì)量濃度約為1 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的配制

稱取適量乳膏，加入甲醇，密封超聲2 h（100 W，50 kHz），離心吸取上清液，用適量甲醇稀釋混勻之后過0.22μm濾膜，按照“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。

2.2.4 線性關(guān)系考察

將混合標準品溶液精確稀釋至25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 μg/mL，按照“2.2.1”項下色譜條件測定。以峰面積（A）對濃度（C，μg/mL）作線性回歸，得標準曲線線性范圍及相關(guān)系數(shù)，S/N ≥3 作為最低檢測限，S/N ≥10作為最低定量限。

2.2.5 精密度試驗

取1.25 μg/mL的混合標準品溶液，重復(fù)進樣6次，按照“2.2.1”項下色譜條件測定。

2.2.6 重復(fù)性試驗

平行制備1.25 μg/mL 混合標準品溶液6 份，按照“2.2.1”項下色譜條件測定。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，按照“2.2.1”項下色譜條件測定。

2.2.8 加樣回收率試驗

取9 份已知準確含有1.53 μg 甾烯的供試品溶液160 μL，分成3 組，分別加入80、100、120 μL 的混標溶液，制備成含低、中、高3 種濃度混標液的混合溶液。按照“2.2.1”項下色譜條件測定，計算回收率。

2.3 乳膏的透皮吸收率測定方法

將豚鼠麻醉后，用寵物剃毛器及8%硫化鈉對豚鼠進行脫毛，用溫水擦拭，直至完全脫毛，略擦干后用剪刀剝離豚鼠腹部皮膚，清除皮下血管及組織，用生理鹽水沖洗干凈。

采用TK-12D 型透皮擴散試驗儀，將豚鼠皮膚（有效擴散面積2.54 cm2）固定在接收池上蓋與接收池之間，鋪平，角質(zhì)層朝上［5-6］。在豚鼠皮上均勻涂抹適量乳膏，在接收池中注入預(yù)熱的接收液（生理鹽水）。對照組為30%乙醇溶解的等量蟾酥提取物。設(shè)置攪拌速度為400 r/min，溫度為（37 ± 0.5）℃。2 h 后取出，用40%乙醇和生理鹽水將豚鼠皮擦拭干凈。剪碎處理豚鼠皮，加入甲醇超聲2 h（100 W，50 kHz），過膜后取適量利用超高效液相色譜檢測。對皮內(nèi)6 種甾烯類物質(zhì)質(zhì)量（μg）進行加和并與乳膏中各物質(zhì)質(zhì)量（μg）之和進行比較，計算透皮吸收率。

2.4 小鼠斷尾止血實驗

將小鼠隨機分成空白組、蟾酥粉組、蟾酥提取物組、乳膏1 組（提取物含量0.5%）和乳膏2 組（提取物含量0.5%），每組8只。將小鼠固定后距尾尖1 cm處用手術(shù)剪斷尾，至第一滴血自然流出后擦拭干凈，開始給藥并計時［7］。粉末或乳膏劑以覆蓋創(chuàng)口為宜。用濾紙片擦拭創(chuàng)面，無滲血現(xiàn)象出現(xiàn)時記為止血時間，將濾紙片干燥后稱重記錄出血質(zhì)量?？瞻捉M剪尾后開始計時，不做其他處理。

2.5 家兔皮膚傷口愈合實驗

將家兔按完全隨機法分為陰性對照組（生理鹽水）、陽性對照組（京萬紅軟膏）和蟾酥乳膏2組（0.5%，m/m），每組6只。參照全層皮膚缺損法［8］制備動物體表一般創(chuàng)面模型。3組兔經(jīng)耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉，脫毛，用酒精消毒后，在背部取2 cm×2 cm的正方形切口，剪開皮膚全層，用碘伏消毒，形成兔全層皮膚缺損開放性創(chuàng)面。次日對無化膿現(xiàn)象的家兔進行給藥（0.2 g/只），每日給藥1次，連續(xù)給藥3周。于D0（形成創(chuàng)面的次日）、D7、D14、D21時拍照留存，采用Image J軟件對創(chuàng)面面積進行計算，并計算創(chuàng)面愈合率。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，各組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 乳膏透皮吸收率結(jié)果

制備的2種乳膏色澤均勻，質(zhì)地細膩，易于涂抹，無粗糙感。離心及室溫、高溫、低溫穩(wěn)定性良好。透皮吸收率結(jié)果如表1所示，表明2種乳膏中甾烯透皮效率與蟾酥溶液相比均有提高。乳膏2 組透皮吸收率略高于乳膏1組。

表1 各組體外透皮吸收率比較（±s，n=3）

表1 各組體外透皮吸收率比較（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

透皮吸收率（%）4.92±0.83 7.23±0.35*7.95±0.41**組別對照組（蟾酥提取物）乳膏1組乳膏2組皮內(nèi)甾烯含量（μg）43.99±9.39 58.65±7.68 65.38±6.47乳膏中甾烯含量（μg）890.71±76.09 769.72±56.08 821.21±51.55

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、酯蟾毒配基和華蟾毒精6 種蟾蜍甾烯類化合物的方法學(xué)考察結(jié)果如表2 所示，結(jié)果顯示各物質(zhì)在0.39～50 μg/mL的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察均良好。6種物質(zhì)的平均加樣回收率均在80%～120%之間，表明該方法具有良好的準確性。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

3.3 小鼠斷尾止血實驗結(jié)果

與空白組比較，蟾酥粉、蟾酥提取物及2 種蟾酥乳膏均可明顯縮短小鼠出血時間（P＜0.01），降低出血量（P＜0.01）。乳膏2 組與乳膏1 組比較，前者出血時間及出血量均較低，且兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明蟾酥乳膏2是較優(yōu)配方，詳見表3。

表3 各組止血時間及出血量比較（±s，n=8）

表3 各組止血時間及出血量比較（±s，n=8）

注：與空白組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別空白組蟾酥粉組氯仿部位干粉組乳膏1組乳膏2組出血量（g，n=8）0.091 0±0.010 00 0.001 7±0.000 62**0.001 9±0.000 57**0.008 1±0.000 95**0.004 1±0.001 10**止血時間（min，n=8）123.79±13.26 11.73±2.05**14.37±2.17**49.70±1.85**46.87±1.22**

3.4 家兔皮膚傷口愈合實驗結(jié)果

結(jié)果表明，給藥的第7 天陰性對照組傷口愈合率較高，但隨時間延長，蟾酥乳膏2 組愈合率逐漸增加。第14、21天時，蟾酥乳膏2組的傷口愈合率與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在愈合過程中發(fā)現(xiàn)，各組家兔基本第3天開始結(jié)痂，而涂抹蟾酥乳膏的家兔普遍掉痂較快，掉痂后創(chuàng)面逐漸縮小，且涂抹過程中無紅斑、紅腫現(xiàn)象出現(xiàn)，表明乳膏2 安全性較好。詳見表4。

表4 各組家兔皮膚傷口愈合率比較（±s，n=6，%）

表4 各組家兔皮膚傷口愈合率比較（±s，n=6，%）

注：與陰性對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別陰性對照組蟾酥乳膏2組京萬紅軟膏（陽藥）組D7 D14 D21 76.12±6.46 89.54±3.07**84.73±4.65 47.90±9.59 32.51±9.33 31.91±12.15 60.41±13.40 82.92±3.26**59.14±7.73

4 討論

皮膚傷口愈合涉及4 個階段，即止血、炎癥、增殖和重塑［9］。止血過程主要涉及血小板的黏附、聚集。之后進入早期愈合過程，表現(xiàn)為低炎癥水平，這是傷口愈合過程的促進因素。在早期階段，傷口周圍的巨噬細胞被活化成M1 表型，對皮膚表面的病原微生物以及細胞碎片等進行吞噬，同時巨噬細胞以及中性粒細胞分泌促炎介質(zhì)和趨化因子，以便于下一階段所需血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等的募集及增殖［10-11］。這些細胞募集到傷口處后，在促炎細胞因子IFN-γ、TGF-β 等的調(diào)節(jié)下，進行血管生成以及再上皮化。在后期愈合過程，巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α等細胞因子來誘導(dǎo)中性粒細胞凋亡，之后從M1 促炎表型轉(zhuǎn)換為M2 抗炎表型，釋放抗炎因子［12-13］。M2 型巨噬細胞同時釋放免疫抑制因子Arg-1 來催化多胺的形成從而促進細胞增殖和膠原沉積，以達到皮膚重塑的目的［14］。

《證治準繩·類方》中寫道“治齒縫中血出上以紙纴，蘸干蟾酥少許，于血出處按之，立止”表明了蟾酥外用止血的潛在功效，但蟾酥在整個傷口愈合過程中是否發(fā)揮積極作用尚未得到證實。另外，蟾酥以粉末形式使用時的用量不易控制，且有刺激性氣味?；诖耍髡咧苽淞送庥^、穩(wěn)定性及透皮吸收率良好的蟾酥乳膏配方，以期開發(fā)出具有促進傷口愈合療效的安全外用制劑［15］。

家兔皮膚傷口愈合實驗結(jié)果中蟾酥乳膏在給藥一周后表現(xiàn)出促進傷口愈合的效果，其機制可能與抗炎作用有關(guān)［16-17］，還有待進一步闡釋。另外，涂抹乳膏后未見兔皮膚出現(xiàn)紅斑、紅腫，顯示了蟾酥乳膏具有一定的安全性。但后續(xù)還需利用皮膚敏感性較高的動物（兔、豚鼠等）［18-20］進行皮膚刺激性評價以及研究不同劑量的蟾酥乳膏對兔皮膚的刺激性以及對傷口愈合的影響。