陳棪焜 冼卓杰 池霖生 黃建洲 馬文敏

廣東省佛山市婦幼保健院輔助生殖技術(shù)中心，廣東佛山 528000

體外受精-胚胎移植技術(shù)是一種人工生育技術(shù)，體外胚胎培養(yǎng)是傳統(tǒng)的胚胎體外培養(yǎng)方式，對移植胚胎是否能夠正常發(fā)育難以保證且容易產(chǎn)生多胎的情況，給順利分娩增加了難度，因此臨床上開始尋找一種能夠有效檢測早期胚胎并提高移植率的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)囊胚培養(yǎng)能夠較為有效的解決這些問題[1-2]。胚胎在培養(yǎng)過程中從受精卵形成4 細(xì)胞、8 細(xì)胞，經(jīng)過融合形成囊胚，囊胚的植入率也相對較高。在正常情況下，母體能夠給胚胎提供最適宜生長和發(fā)育的環(huán)境條件，且能夠隨時進(jìn)行代謝更新，以避免代謝物質(zhì)產(chǎn)生的毒副作用對胚胎的發(fā)育產(chǎn)生影響。胚胎實驗室無法滿足上述條件，其進(jìn)行的體外培養(yǎng)雖然已經(jīng)盡量貼近母體內(nèi)的環(huán)境，提供胚胎發(fā)育的各種條件，但仍然存在一定的差異性，外界因素仍會對其產(chǎn)生影響，同時，不同生殖實驗室在培養(yǎng)時所使用的方法也存在差異性[3-4]。其中，臨床在關(guān)于進(jìn)行囊胚培養(yǎng)實驗時對密度的選擇方面存在有較多爭議，為探究適宜的培養(yǎng)密度，本研究對不同密度培養(yǎng)下的胚胎培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至12月佛山市婦幼保健院接受體外受精移植的235 例體外受精胚胎移植患者為研究對象，患者年齡為31～40 歲，平均（34.55±4.21）歲；文化程度：小學(xué)及以下學(xué)歷15 例，中學(xué)67例，?？?、本科82 例，碩士及以上學(xué)歷71 例；不育年限1～12年，平均（4.75±1.26）年；焦慮自評量表[5]評分為39～61 分，平均（50.22±3.17）分；抑郁自評量表[5]評分為37～62 分，平均（51.24±3.61）分。共移植培養(yǎng)裂卵期胚胎1181 個，按照培養(yǎng)密度差異分為四組，分別為單獨培養(yǎng)為A 組，2～3 個集中培養(yǎng)為B 組，4～5 個集中培養(yǎng)為C 組，6 個以上集中培養(yǎng)為D 組，其中A 組培養(yǎng)囊胚共269 個，B 組培養(yǎng)囊胚共298 個，C 組培養(yǎng)的囊胚共304 個，D 組培養(yǎng)囊胚共310 個。患者對本研究內(nèi)容知情并簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：均順利完成體外受精且受精卵在3 d內(nèi)發(fā)育狀況良好者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：胚胎為卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受 精；補 救ICSI 周期性的胚胎；胚胎發(fā)育與至第5 天處于桑葚狀態(tài)即將被移植或進(jìn)行冷凍；受精成功后未能正常發(fā)育的胚胎；患者抑制胚胎超過卵裂期胚胎。

1.2 方法

所有胚胎均于取卵后第3 天進(jìn)行囊胚體外培養(yǎng)，分別采用單獨培養(yǎng)與不同囊胚數(shù)量集中培養(yǎng)，在開始囊胚培養(yǎng)的前一天下午制備囊胚培養(yǎng)器皿，使用囊胚培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中制作30 μl 的微滴并在上面覆蓋培養(yǎng)油制成胚胎囊胚期的培養(yǎng)皿。單獨培養(yǎng)囊胚組每次取1 個裂卵期胚胎轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，集中培養(yǎng)組分別按照每組的培養(yǎng)數(shù)量分別取每2～3 個、4～5 個以及6 個以上的裂卵期胚胎轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，所有胚胎均在相同的混合氣體培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。對幾組囊胚形成的結(jié)果進(jìn)行觀察比較。

為控制研究質(zhì)量，在進(jìn)行胚胎評估時由3 名具備豐富經(jīng)驗的胚胎工作者同時進(jìn)行評估，當(dāng)評估意見無法統(tǒng)一時采用無記名投票的方式進(jìn)行評估結(jié)果收集，以多數(shù)結(jié)果作為最終評估結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

①四組囊胚培養(yǎng)結(jié)果比較：囊胚期對四組囊胚形成率、可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率進(jìn)行比較。囊胚等級使用Gardner 評分系統(tǒng)[5]進(jìn)行評價，首先根據(jù)囊胚擴(kuò)展及孵出程度進(jìn)行1～6 級評價，1 級為早期囊胚，囊胚胚腔體積低于囊胚總體積的一半；2 級為囊胚胚腔體積達(dá)到囊胚體積的一半以上；3 級為完全擴(kuò)展的囊胚，囊胚胚腔占據(jù)整個囊胚；4 級為擴(kuò)展后囊胚，囊胚腔體與移植培養(yǎng)初期相比明顯擴(kuò)大，透明帶有變薄跡象；5 級為正在孵化的囊胚，囊胚自透明帶裂口中孵出；6 級為孵化出的囊胚，囊胚已經(jīng)完全從透明帶中脫出。可利用囊胚評價標(biāo)準(zhǔn)為Gardner 評分系統(tǒng)[5]評價結(jié)果等級不低于2 級的囊胚，優(yōu)質(zhì)囊胚評價標(biāo)準(zhǔn)為4 級及以上的囊胚。②四組形成囊胚等級差異比較：參照Gardner 評分系統(tǒng)[5]依據(jù)囊胚腔、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以及滋養(yǎng)層細(xì)胞對所有形成的囊胚進(jìn)行等級評價，其中，囊胚腔分6 期，1 期表示囊胚腔占據(jù)囊胚總體積一半以下；2 期表示囊胚腔占據(jù)囊胚總體積一半以上；3 期表示囊胚腔完全占據(jù)胚胎的總體積；4 期表示囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變??；5 期表示正在孵出的胚胎，胚胎的一部分從透明帶逸出；6 期表示孵出的胚胎，囊胚完全從透明帶中逸出。③四組著床情況及妊娠結(jié)局比較：將形成的囊胚全部進(jìn)行囊胚移植，于B 超下看到妊娠囊確定為臨床妊娠標(biāo)準(zhǔn)[6]；著床率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS21.0 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計數(shù)資料使用率表示，組間比較及多組率的整體比較使用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。多組率的兩兩比較采用Bonferroni 方法校正，檢驗水準(zhǔn)α=原α 水平/比較次數(shù)，即0.05/6≈0.008。

2 結(jié)果

2.1 四組胚胎囊胚培養(yǎng)結(jié)果的比較

四組的囊胚形成率、可利用囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C 組的囊胚形成率、可利用囊胚率高于A、B、D 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.008），優(yōu)質(zhì)囊胚率高于A、B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.008）（表1）。

表1 四組胚胎囊胚培養(yǎng)結(jié)果的比較[n（%）]

2.2 四組胚胎形成囊胚等級差異的比較

四組胚胎共形成778 個胚囊。四組囊胚形成的等級比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。C 組的囊胚4～6期占比高于A、B、D 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.008）（表2）。

表2 四組胚胎形成囊胚等級差異的比較[n（%）]

2.3 四組胚囊著床情況及妊娠結(jié)局的比較

四組囊胚囊胚著床率、臨床妊娠率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C 組的囊胚著床率、臨床妊娠率高于A、B、D 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 四組胚囊著床情況及妊娠結(jié)局的比較[n（%）]

3 討論

體外受精-胚胎移植技術(shù)作為人類輔助生殖技術(shù)在臨床上是十分重大的一項突破，20 世紀(jì)60年代初至80年代中期，人們以各種哺乳動物為實驗材料，進(jìn)行了大量基礎(chǔ)研究，在精子獲能機理和獲能方法方面取得很大進(jìn)展。這為之后臨床上應(yīng)用該項技術(shù)治療不孕患者提供了早期的理論基礎(chǔ)。在對不孕癥患者的治療中，體外受精技術(shù)與胚胎移植技術(shù)具有明顯的相關(guān)性，當(dāng)受精卵經(jīng)人工孵育在適宜的條件下分裂達(dá)到8～16 個卵裂細(xì)胞時，再使用人工方法移入分泌期的婦女子宮內(nèi)，使孕卵著床，進(jìn)而使其懷孕并通過宮內(nèi)孕育順利產(chǎn)下胎兒[7]。體外受精和胚胎移植技術(shù)相結(jié)合，也就是通常所說的“試管嬰兒”技術(shù)，隨著科學(xué)的發(fā)展，這一技術(shù)在不孕癥治療中將發(fā)揮更大作用。一個優(yōu)化的培養(yǎng)體系能夠使有活力的胚胎在體外或移植后形成囊胚并最終發(fā)展為正常胎兒[8-9]。通常對患者進(jìn)行取卵后4～6 h 內(nèi)將經(jīng)過處理的丈夫精子與卵子一起培養(yǎng)，精子通過自身的運動進(jìn)入到卵細(xì)胞中兩性的遺傳物質(zhì)結(jié)合進(jìn)而形成受精卵，最后經(jīng)過培養(yǎng)就能夠形成4 細(xì)胞、8 細(xì)胞的胚胎，囊胚培養(yǎng)是胚胎在體外培養(yǎng)的終末階段，進(jìn)行囊胚移植通常能夠獲得較高的胚胎植入率并能夠有效避免多胎的形成，因此進(jìn)行囊胚培養(yǎng)和移植是臨床醫(yī)患都更為認(rèn)可的選擇，而在體外培養(yǎng)階段影響其質(zhì)量因素很多。

臨床研究發(fā)現(xiàn)實驗室培養(yǎng)的環(huán)境以及胚胎形態(tài)都會對最終的發(fā)育形成影響。胚胎培養(yǎng)實驗室已經(jīng)應(yīng)用了人類發(fā)展的高科技產(chǎn)物[10-11]。但在自然狀態(tài)下，母體能夠提供胚胎在免光照、恒溫、恒氣體分壓即最符合胚胎需要的二氧化碳、氧、氮分壓等環(huán)境因素、最合理配比的營養(yǎng)物質(zhì)及對胚胎發(fā)育至關(guān)重要的必要性細(xì)胞因子而且這些物質(zhì)隨時保持動態(tài)更新、不存在代謝廢物過度堆積的情況也就不會對胚胎產(chǎn)生毒副作用影響。這些條件在胚胎實驗室里能夠最大限度的進(jìn)行粗略模擬但是卻難以完全達(dá)到[12-13]。佛山市婦幼保健院具有成熟的體外受精-胚胎移植技術(shù)，在進(jìn)行胚胎移植的過程中發(fā)現(xiàn)即使對培養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格控制仍然難以保證囊胚質(zhì)量及移植成功率，因此考慮囊胚的發(fā)育結(jié)果和其培養(yǎng)時選擇的密度差異存在一定的影響[14-15]。對于囊胚培養(yǎng)的密度選擇在不同的胚胎實驗室都會有不同的選擇，部分胚胎工作者認(rèn)為進(jìn)行單一的培養(yǎng)更加利于對胚胎發(fā)育狀況進(jìn)行追蹤，且囊胚不會受到周圍囊胚代謝的毒副產(chǎn)物的影響，但是也有學(xué)者指出囊胚自分泌和旁分泌的相關(guān)生長因子對其發(fā)育存在積極影響[16-17]。在進(jìn)行群體培養(yǎng)時通常會定時對培養(yǎng)液進(jìn)行更換以補償其代謝毒性，而這種方式會對胚胎的發(fā)育造成影響，將自分泌生長因子和旁分泌生長因子也去除了[18-19]。因此如何選擇囊胚培養(yǎng)的密度仍然沒有統(tǒng)一定論，同時從胚胎培養(yǎng)發(fā)育的機制來看密度對囊胚存在明顯影響。本研究結(jié)果顯示，C 組的囊胚形成率、可利用囊胚率以及優(yōu)質(zhì)囊胚率均高于A、B、D 組（P＜0.008），提示培育過程中將培養(yǎng)密度保持為4～5 個集中培養(yǎng)囊胚的發(fā)育潛能更好。本研究結(jié)果顯示，C 組的囊胚4～6 期占比高于A、B、D 組，囊胚著床率、臨床妊娠率高于A、B、D 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.008），提示該培養(yǎng)密度的優(yōu)勢。本研究在相同培養(yǎng)液容積的情況下進(jìn)行不同數(shù)量的囊胚培養(yǎng)，A、B 兩組僅集中培養(yǎng)1～3 個囊胚，培養(yǎng)密度較大，而D 組集中培養(yǎng)囊胚數(shù)量在6 個以上，囊胚間的密度較小，幾種培養(yǎng)密度下胚胎的質(zhì)量以及其發(fā)育潛能甚至移植成功率均較低，提示在進(jìn)行囊胚培養(yǎng)時應(yīng)當(dāng)根據(jù)培養(yǎng)液容量選擇合適的培養(yǎng)密度進(jìn)行囊胚培養(yǎng)以增加培養(yǎng)成功率及移植成功率，對患者的妊娠結(jié)果具有改善作用。

綜上所述，培養(yǎng)囊胚時囊胚培養(yǎng)密度為1～3 個以及6 個以上集中培養(yǎng)的囊胚的發(fā)育潛能低，可利用囊胚的形成、最終的著床及妊娠結(jié)果對比差異也低，4～5個囊胚集中培養(yǎng)密度環(huán)境下囊胚的培養(yǎng)結(jié)果更好，且囊胚培養(yǎng)時密度不宜過大也不宜過小，應(yīng)該根據(jù)培養(yǎng)液的容量大小進(jìn)行密度選擇以提高胚胎移植率和患者臨床妊娠率。