王 順 劉桃源 李 昂 衣同輝 潘洪明 李淑艷

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

肝癌是一種惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤發(fā)病中排名第六位，5年生存率僅為18%[1]，肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌4/5[2]。肝細(xì)胞癌起病隱匿，臨床癥狀不明顯，多數(shù)患者確診已屬于中晚期[3]。傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療等的治療效果均不理想，同時(shí)傳統(tǒng)的化療藥物副作用大，易出現(xiàn)多藥耐藥性，因此，探索高效低毒的抗腫瘤新藥是醫(yī)藥研究的首要任務(wù)。生物活性肽廣泛存在于自然界的生命體中，包括細(xì)菌、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物及脊椎動(dòng)物中[4]。生物活性肽具有抗菌、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等功能[5]，分子量相對(duì)較大的生物活性肽提純及合成難度大，副作用也大。因此，研發(fā)分子量小、具有高特異性、高效性、低毒性的抗癌生物活性肽成為近年來(lái)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[6-7]。腫瘤抑素是膠原蛋白Ⅳα3鏈非膠原區(qū)域的生物活性多肽片段[8]，腫瘤抑素靠近C 端的第185～203 位氨基酸之間的區(qū)域稱為腫瘤抑素19 肽。研究發(fā)現(xiàn)[9]，19 肽能抑制新生血管形成，誘導(dǎo)黑色素瘤等細(xì)胞凋亡，對(duì)低分化SGC-7901胃癌細(xì)胞、HepG2 肝癌細(xì)胞也有抑制增殖作用[10-11]。但19 肽對(duì)肝癌SK-Hep-1 細(xì)胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移能力的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本課題研究19 肽對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞增殖能力和凋亡作用的影響，探討19 肽對(duì)SKHep-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，為肝癌的生物治療提供臨床應(yīng)用的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1 購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清購(gòu)自Biosharp 公司；腫瘤抑素19 肽購(gòu)自安徽國(guó)肽生物科技有限公司；DMEM-H 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAPI 熒光染料購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 19 肽對(duì)SK-Hep-1 細(xì)胞增殖能力的影響 SKHep-1用含10%胎牛血清的DMEM-H 培養(yǎng)基在37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度90%以上時(shí)，用0.25%胰酶消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml，每孔100 μl 接種于96 孔板中培養(yǎng)。向各孔中加入19 肽（濃度分別為0、50、100、150、200、250 μg/ml，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔）。分別培養(yǎng)24、48 h后，在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)吸光度值。通過(guò)計(jì)算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），篩選出19 肽最佳作用濃度。

1.2.2 DAPI 染色觀察SK-Hep-1 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 19 肽處理細(xì)胞同“1.2.1 項(xiàng)”。細(xì)胞按1×106個(gè)/孔，接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)24 h，用PBS 洗1次，每孔加4%多聚甲醛溶液，置-20℃固定20 min，PBS洗2 次，加DAPI 染液室內(nèi)避光染色10 min，PBS洗2次，鏡下340 nm 波長(zhǎng)激發(fā)熒光，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞處理同“1.2.1項(xiàng)”，按1×106個(gè)/孔/3 ml，接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)24 h，用PBS 洗2 次，加入100 μl 膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC 和5 μl PIstaining solution，混均室溫避光孵育10 min，染色完成后，加入400 μl 膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液，混勻，用流式細(xì)胞儀在488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)、530 nm 發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Graphpad 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 19 肽對(duì)肝癌SK-Hep-1 細(xì)胞增殖活性的抑制作用

0、50、100、150、200、250 μg/ml 濃度的19 肽作用SK-Hep-1 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞存活率分別為（100.00±1.80）%、（95.64±1.92）%、（82.18±1.67）%、（68.43±1.39）%、（46.74±1.35）%、（42.49±1.85）%。作用48 h 后細(xì)胞存活率分別為（100.00±1.80）%、（87.27±1.96）%、（66.32±1.74）%、（58.78±1.94）%、（40.40±1.44）%、（22.15±1.51）%。細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制。19肽作用24 h 的IC50為200.00 μg/ml（圖1）。

圖1 19 肽對(duì)SK-Hep-1 細(xì)胞增殖活性的抑制作用

2.2 DAPI 染色觀察SK-Hep-1 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

如圖2 所示（封三），19 肽為0 μg/ml 時(shí)，SK-Hep-1細(xì)胞大部分染色均勻，呈藍(lán)色，細(xì)胞未發(fā)生凋亡。與0 μg/ml 相比，50、100、150、200、250 μg/ml 濃度 的19肽作用24 h 后，部分細(xì)胞呈亮藍(lán)色，細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮、破裂、碎塊狀致密濃染或帽點(diǎn)狀凋亡形態(tài)，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡比率增高。

2.3 19 肽對(duì)肝癌SK-Hep-1 細(xì)胞凋亡率的影響

0、100、150、200、250 μg/ml 的19 肽作用SK-Hep-1細(xì)胞24 h 后，凋亡率分別為（13.15±0.42）%、（13.87±0.64）%、（17.15±0.68）%、（26.84±0.40）%、（32.24±0.41）%。細(xì)胞凋亡率隨著19 肽濃度的增高而增加（圖3）。

圖3 19 肽對(duì)Sk-hep-1 細(xì)胞凋亡率的影響

3 討論

肝癌是一種惡性腫瘤，在我國(guó)發(fā)病率和致死率相當(dāng)[12]，其治療方法以手術(shù)、放療、靶向及小分子化學(xué)藥物為主，手術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高，放療和化療又存在特異性和敏感性差等問(wèn)題[13]。而生物活性肽具有多種生理功能，如抗氧化、抗增殖和免疫功能等作用[14]，生物活性肽的這些活性具有抗癌潛力，有利于癌癥治療研究。腫瘤抑素是一種生物活性肽，具有抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，但存在分子量大，相對(duì)副作用也大，以及存在難以提取或者合成等問(wèn)題[15]。腫瘤抑素19 肽是通過(guò)肽的固相合成技術(shù)對(duì)腫瘤抑素進(jìn)行改造修飾的小分子多肽，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究探討19 肽對(duì)SK-Hep-1 細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制，結(jié)果顯示CCK-8 實(shí)驗(yàn)中，在24 h 的SK-Hep-1 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)19 肽濃度為0～100 μg/ml 時(shí)，細(xì)胞存活率下降趨勢(shì)較為平緩；19 肽濃度處于100～250 μg/ml 時(shí)，細(xì)胞存活率下降較陡直，提示隨著19肽濃度的增加，肝癌SK-Hep-1 細(xì)胞的存活率逐漸降低。表明0～100 μg/ml 為平緩期，細(xì)胞對(duì)19 肽耐受；濃度在150～250 μg/ml 時(shí)，19 肽抑制SK-Hep-1細(xì)胞的增殖能力逐漸增強(qiáng)。另外，賀巖[10]動(dòng)態(tài)觀察到19 肽對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖有抑制作用，表明19 肽具有抑制消化道腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

凋亡在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中至關(guān)重要，抗肝癌藥物根除癌細(xì)胞主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)[16]。本研究DAPI 染色檢測(cè)可見(jiàn)，19 肽作用后SK-Hep-1 細(xì)胞的細(xì)胞膜變圓，細(xì)胞核大小不一，出現(xiàn)核內(nèi)部染色質(zhì)聚集、斷裂，形成半月?tīng)罨蛎秉c(diǎn)狀。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步研究19 肽對(duì)肝癌SK-Hep-1 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，隨著19 肽濃度的增加，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的概率均增加。19 肽濃度在0～100 μg/ml 時(shí)，細(xì)胞的凋亡率變化相對(duì)較?。?2.73%～14.51%）；19 肽濃度處于150～250 μg/ml 時(shí)，細(xì)胞的凋亡率變化幅度較大（14.51%～32.65%）。推測(cè)SK-Hep-1 細(xì)胞可能對(duì)低濃度的19 肽（0～100 μg/ml）具有耐受性，超過(guò)此范圍，稍微增加劑量就可以顯著增加細(xì)胞的凋亡率。

衣同輝等[11]發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑素19 肽能協(xié)同人參皂苷Rg3 誘導(dǎo)肝癌HepG2 細(xì)胞的凋亡。兩者聯(lián)合時(shí)，減少了人參皂苷Rg3 的用藥劑量，同時(shí)增加了療效?？梢?jiàn)19 肽聯(lián)合藥物治療腫瘤能減少化療藥物劑量，對(duì)療效具有正相協(xié)同作用。

綜上所述，19 肽能夠抑制肝癌SK-Hep-1 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，今后將進(jìn)一步探討19 肽對(duì)SKHep-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制，以及19 肽與化療藥物聯(lián)合治療腫瘤的效果及機(jī)制。為臨床腫瘤的生物治療提供理論指導(dǎo)。