劉 燕，朱金鳳

(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧業(yè)工程學(xué)院,河南鄭州 451450)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是養(yǎng)豬業(yè)中常見的病毒之一，該病毒可以感染不同階段的豬，可以引起仔豬消瘦、關(guān)節(jié)腫脹、呼吸系統(tǒng)疾病及母豬繁殖障礙等一系列疾病，可以造成嚴重的免疫抑制，影響疫苗的免疫效果，同時可以引起其他病原的混合感染，給相關(guān)疾病的診斷與治療帶來一定困難[1-2]。PCV主要有PCV1型和PCV2型2個血清型，其中PCV1型一般不具備致病性，PCV2型可以引起仔豬一系列的疾病，具有較強的致病性[3-4]。2016年美國學(xué)者首次分離得到豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)，隨后從印度、日本及我國等多個國家均從患病豬檢測到了PCV3，且PCV3可以引起豬的系統(tǒng)炎性疾病、皮炎腎病綜合征及胎兒流產(chǎn)等疾病，該病已經(jīng)成為造成養(yǎng)豬業(yè)損失的重要病因之一[5]。相關(guān)研究表明，PCV3與PCV1和PCV2具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，其基因組長度為2 000 bp，主要包含2個開放性閱讀框ORF1和ORF2，ORF2基因組結(jié)構(gòu)中主要編碼衣殼蛋白(Cap) 和復(fù)制酶(Rep)，且Cap蛋白是PCV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白和主要抗原[6-7]。

本試驗2017年-2019年采集鄭州地區(qū)規(guī)?；i場、散養(yǎng)豬場中患病豬的淋巴結(jié)、脾臟、腎臟及血清樣品1 175份，檢測PCV3流行情況，分析其選擇代表株的Cap基因的遺傳變異情況，為該地區(qū)豬場中PCV3流行病學(xué)調(diào)查及綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2017年-2019年采集鄭州地區(qū)豬場中患病豬的淋巴結(jié)、脾臟、腎臟及血清樣品1 175份，其中2017年采集379份，2018年采集395份，2019年采集401份。

1.1.2 主要試劑 病毒DNA提取試劑盒、瓊脂糖DNA回收試劑盒、DNA標準DL 2 000、ExTaqDNA聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 多功能PCR儀、凝膠成像儀，ThermoFisher公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組DNA的提取 將采集的病料樣品組織加入等量的無菌的PBS均漿，在-80℃反復(fù)凍融3次～5次，離心后取上清，用0.2 μm過濾后加入10 mg/mL雙抗處理0.5 h，參照病毒DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCV3的PCR鑒定 參考文獻[8-9]，參照GenBank中登錄的基因序列，設(shè)計PCV3特異性鑒定引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用1.2.1中提取的病毒基因組DNA為模板進行PCR鑒定，回收PCR產(chǎn)物，連接到18T提取質(zhì)粒進行測序，與GenBank中登錄的PCV3參考株進行同源性比對。

表1 引物序列

1.2.3 PCV3的Cap基因檢測與測序 參照文獻[10]，設(shè)計PCV3Cap基因引物(表1)。用1.2.1中提取的病毒基因組DNA為模板，挑選代表毒株進行Cap基因檢測，回收PCR產(chǎn)物，連接到18T提取質(zhì)粒進行測序，分析其遺傳變異情況。采用DNAMan軟件和MEGA6軟件與GenBank登錄的PCV3參考株的Cap蛋白基因序列進行對比分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 PCV3的PCR檢測結(jié)果

用PCV3特異性鑒定引物對采集的樣品進行PCR鑒定，部分樣品均擴增出大約為330 bp大小的目的條帶(圖1)，陽性的樣品連接T載體測序后，其測序結(jié)果與GenBank中登錄的PCV3參考株同源性在均大于97.0%。

M.DNA 標準DL 2 000;1～5.部分樣品

2.2 病料的PCV3檢測結(jié)果

對2017年-2019年采集采集鄭州地區(qū)豬場中患病豬樣品1 175份進行PCV3檢測，結(jié)果由表2可知，2017年-2019年的PCV3總陽性率為14.6%，2017年、2018年和2019年的陽性率分別為9.5%、14.4%和19.5%，其中以2019年陽性率最高，呈現(xiàn)逐年升高的趨勢。

表2 PCV3型檢測結(jié)果

2.3 PCV3的Cap基因檢測與測序結(jié)果

對2017年-2019年采集鄭州地區(qū)豬場中患病豬樣品中檢測出PCV3陽性樣品中選擇8個代表株進行Cap基因PCR檢測，采用DNAMan軟件和MEGA6軟件與GenBank 登錄的PCV3參考株的Cap蛋白基因序列進行對比分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，8個代表株P(guān)CV3均擴增到Cap基因，與預(yù)期的大小相符(圖2)。8個代表株P(guān)CV3Cap基因序列與GenBank登錄的12株參考株的同源性在92.%～100%之間。系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，7個代表株P(guān)CV3的Cap基因序列與12株參考株位于一個大的分支，另外1株單獨構(gòu)成一個分支(圖3)，通過基因分析，8個代表株P(guān)CV3Cap基因序列未出現(xiàn)明顯的遺傳變異，只是幾個堿基發(fā)生變化。

M.DNA 標準DL 2 000;1.空白對照；2～7:部分樣品

圖3 PCV3 Cap基因系統(tǒng)進化樹

3 討論

相關(guān)研究表明，2017年美國研究者從皮炎腎病綜合征和患有繁殖障礙疾病的母豬中檢測出PCV3，且皮炎腎病綜合征的發(fā)病率越高，PCV3感染率越高，在患有繁殖疾病的母豬中及患有仔豬先天性震顫的仔豬中檢測到唯一的病原體為PCV3，說明PCV3對豬的危害很嚴重[6-7]。許多相關(guān)研究表明，PCV3與臨床中許多疾病產(chǎn)生的臨床癥狀相關(guān)，可能對不同階段的豬產(chǎn)生致病性[11-12]。因此，PCV3可能對養(yǎng)豬業(yè)存在潛在的威脅，應(yīng)該引起重視。隨著豬養(yǎng)殖數(shù)量的逐年增多，其PCV3陽性率也在增高，且在我國豬場中分布較廣泛[13-14]。本試驗2017年-2019年采集鄭州地區(qū)規(guī)?；i場中患病豬的1 175份樣品中PCV3總陽性率為14.6%，呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，其中2019年陽性率最高(19.5%)，說明該地區(qū)豬場中的PCV3分布較廣泛，且在流行。目前PCV3沒有疫苗和有效藥物和進行防治，尤其是規(guī)模化豬場中應(yīng)該注重該病的凈化與綜合防控。

PCV3在鄭州地區(qū)豬場中廣泛流行，為了解該地區(qū)PCV3分子流行病學(xué)情況，選擇8個代表株進行Cap基因檢測與測序，分析其遺傳變異情況。結(jié)果顯示，8個代表株P(guān)CV3Cap基因序列與GenBank登錄12株參考株的同源性在92.%～100%之間；7個代表株P(guān)CV3的Cap基因序列與12株參考株位于一個大的分支，另外1株單獨構(gòu)成一個分支，8個代表株P(guān)CV3Cap基因序個別幾個堿基發(fā)生變化，未出現(xiàn)明顯的遺傳變異情況。說明該地區(qū)豬場流行的PCV3Cap基因序列未發(fā)生變異情況。PCV3Cap基因個別幾個堿基發(fā)生變化是否與其致病性有關(guān)，有待進一步研究。郭影成等[14]研究表明，吉林地區(qū)PCV3Cap蛋白氨基酸發(fā)生變化。黃翠琴等[15]研究表明，2015年-2017年福建地區(qū)流行的PCV3Cap基因序列發(fā)生變化，且氨基酸序列替換。本研究結(jié)果與上述報道存在一定差異，可能與地區(qū)及PCV3遺傳變異有關(guān)。本研究結(jié)果可為該地區(qū)豬場中PCV3流行病學(xué)調(diào)查及綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。