王 斌，李思聰，李金良，梁 歌，張 敏，袁定勝，楊 銳，李旭廷

(四川省畜牧科學研究院/動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066)

氟苯尼考(florfenicol，F(xiàn)FC)是甲砜霉素的單氟衍生物，其作用機制及抗菌譜與甲砜霉素、氯霉素相同，能通過抑制細菌70S核糖體，與50S亞基結合，抑制肽酰基轉移酶活性，從而抑制肽鏈的延伸，干擾細菌蛋白質的合成，因而對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抑制作用。目前，氟苯尼考被廣泛應用于獸醫(yī)臨床防治革蘭氏陽性、革蘭氏陰性以及甲砜霉素耐藥性細菌病，因其抗菌譜廣、吸收良好、體內分布廣泛，在畜禽和水產(chǎn)動物的細菌性疾病防治中應用廣泛[1]。川續(xù)斷(DipsacusasperWall)是川續(xù)斷科、川續(xù)斷屬多年生草本植物，川續(xù)斷提取物主要含有生物堿、揮發(fā)油、三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類等成分，其中三萜皂苷類成分為川續(xù)斷的主要活性成分，川續(xù)斷中共有川續(xù)斷皂苷Ⅵ、川續(xù)斷皂苷Ⅹ、川續(xù)斷皂苷B等20種三萜皂苷類成分，具有促進骨骼生長、預防肝損傷、治療心腦血管疾病等豐富的藥理作用[2]，在畜禽養(yǎng)殖上，川續(xù)斷可用于促進動物生長，提高機體的非特異性免疫功能[3]。

中草藥和西藥相互作用的研究報道很多[4]，項目組近年也開展了冰片、雙黃連口服液、黃連素、黃芩苷等對氟苯尼考代謝的影響研究[5-7]。目前國內外關于川續(xù)斷提取物對西藥的影響研究較少，本文開展川續(xù)斷提取物在肉雞體內對氟苯尼考代謝的影響研究，探討可能發(fā)生的藥物動力學相互作用及其機制，補充對川產(chǎn)道地藥材川續(xù)斷的藥理學數(shù)據(jù)，為挖掘川續(xù)斷的藥用價值，也為推動中西結合藥物動力學發(fā)展提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 30只大恒699公雞，體重2.0 kg±0.1 kg，購自四川大恒家禽育種有限公司；飼料為不含任何抗生素和抗菌藥的全價日糧，由動物遺傳育種四川省重點實驗室配置。

1.1.2 主要儀器 UltiMate3000高效液相色譜儀，美國戴安公司產(chǎn)品；ZGDCY-48S水浴氮吹儀，上海梓桂儀器有限公司產(chǎn)品；CQ250超聲洗滌器，上海超聲儀器廠產(chǎn)品；800B臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；WH-3微型旋渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠產(chǎn)品；MiniSpin Plus個人型高速離心機，德國艾本德公司產(chǎn)品；Step One型熒光定量PCR儀，美國應用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.1.3 藥品與試劑 川續(xù)斷提取物(每克相當于原生藥3.3 g，含川續(xù)斷皂苷Ⅵ≥6.6%)，動物遺傳育種四川省重點實驗室自制；氟苯尼考對照品(編號K0301703，含量為99.1%)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；氯霉素標準品(批號130555-201704)，中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；氟苯尼考原料藥(批號202012125，純度為98.9%)，浙江康牧藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈(色譜純)，艾萬拓化工產(chǎn)品貿易(上海)有限公司產(chǎn)品；乙酸乙酯等其余試劑均為分析純，成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方法 30只健康雞隨機分為2組，每組15只。試驗組連續(xù)7 d每天灌服川續(xù)斷提取物(0.3 g/kg，1次/d)，空白組則給予相應體積的生理鹽水，禁食12 h后于第8天，氟苯尼考按劑量30 mg/kg(氟苯尼考原粉溶于100 g/L PEG-400配制成10 mg/mL溶液)分別灌服2個組的各10只雞，并于給藥后0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h翅下靜脈采集血液約0.5 mL，EDTA抗凝，4 000 r/min離心5 min，分離血漿，置-20℃冰箱中保存待用。兩個組剩余各5只雞于第8天放血處死，分離肝臟和空腸組織于-80 ℃保存。

1.2.2 樣品的處理 精確取血漿0.2 mL于試管中，加入10 μL氯霉素內標液(500 μg/mL)和800 μL乙酸乙酯，渦動混合2 min，4 000 r/min離心10 min，吸取上層液于另一離心管中，然后再加入乙酸乙酯800 μL重復提取1次，合并2次提取液。在40 ℃水浴中氮氣吹干，殘渣加入400 μL流動相溶解，渦動混合2 min，12 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至進樣瓶，取20 μL進樣檢測。

1.2.3 標準曲線的制備 取空白血漿180 μL，加入20 μL氟苯尼考系列標準溶液，配制成50、20、10、5.0、2.5、0.5、0.1、0.05 μg/mL系列標準血漿樣品，按“1.2.2”項下方法處理樣品，以氟苯尼考與氯霉素峰面積的比值對相應氟苯尼考濃度作線性回歸，求回歸方程和相關系數(shù)。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：Agilen HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(27∶73，V/V)；流速1.0 mL/min；檢測波長223 nm；柱溫40 ℃；進樣量20 μL。

1.2.5 分析方法質量控制 以血漿樣品高、中、低(0.1 μg/mL、2.5 μg/mL、20 μg/mL)3個濃度氟苯尼考考察方法的提取回收率和精密度，每個樣品做5個重復，測得方法回收率分別為83.2%±1.6%、84.1%±2.3%和83.5%±2.2%，測得日內RSD分別為4.6%、2.3%和6.1%，測定日間RSD分別為4.5%、2.1%和6.2%。按信噪比S/N=3計算，最低檢測限為0.02 μg/mL。

1.2.6 RT-PCR檢測雞肝臟和空腸CYP3A37、MDR1和CXR mRNA表達量 取100 mg組織用組織破碎儀進行破碎，按照說明書用Trizol法提取組織總RNA。測定樣品OD 260 nm/OD 280 nm比值，確定RNA濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。用反轉錄試劑盒將RNA反轉成cDNA，利用Premier5.0軟件設計雞CYP3A37、MDR1、CXR和看家基因β-actin引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實時熒光定量PCR檢測上述基因mRNA轉錄水平，PCR反應體系20 μL：cDNA 模板2 μL；上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL；SybrGreen qPCR Master Mix10 μL；ddH2O 7.2 μL。反應程序如下：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 10 s，55 ℃～61 ℃ 15 s；72 ℃ 20 s，共45個循環(huán)；60 ℃延伸1 min。結果采用相對定量分析，用ΔCt法計算基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

2.1 標準曲線

以氟苯尼考與氯霉素峰面積的比值對相應氟苯尼考濃度作線性回歸，求回歸方程和相關系數(shù)。得出氟苯尼考在濃度為0.05 μg/mL～50 μg/mL的范圍內線性關系良好，回歸方程為y=0.056 5x+0.021 8，相關系數(shù)R2=0.999 7。標準曲線見圖1。

圖1 血漿藥物濃度標準曲線

2.2 藥物動力學參數(shù)

試驗組和對照組雞均按單劑量(30 mg/kg)給予氟苯尼考后，測定不同時間點的氟苯尼考血藥濃度，其血藥濃度-時間曲線見圖2所示，藥物動力學參數(shù)見表2。結果表明，試驗組AUC(0-∞)為57.907 mg/L·h±8.12 mg/L·h，與對照組47.729 mg/L·h±11.601 mg/L·h相比顯著增加(P<0.05)，半衰期T1/2為3.649 h±0.193 h，與對照組2.520 h±0.255 h相比顯著增加(P<0.05)，達峰時間Tmax為0.688 h±0.139 h，與對照組1.250 h±0.141 h相比顯著降低(P<0.05)，清除率CL為0.426 L/h·kg±0.071 L/h·kg，與對照組0.657 L/h·kg±0.148 L/h·kg相比顯著降低(P<0.05)，表觀分布容積(Vd)、達峰濃度(Cmax)、平均駐留時間MRT(0-∞)，試驗組和對照組之間差異不顯著。

表2 試驗組和對照組在雞體內的氟苯尼考(30 mg/kg)藥物動力學參數(shù)

圖2 氟苯尼考在試驗組和對照組雞體內的(30 mg/kg)的血藥濃度-時間曲線

2.3 川續(xù)斷提取物對雞肝臟和空腸中CYP3A37、MDR1和CXR mRNA表達的影響

結果如圖3和圖4所示，雞按0.3 g/kg連續(xù)口服7 d川續(xù)斷提取物后，肝臟和空腸中CYP3A37、和CXR mRNA顯著低于對照組(P<0.05)，MDR1 mRNA表達水平也低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 雞口服川續(xù)斷提取物對肝臟中CYP3A37、MDR1和CXR表達的影響

圖4 雞口服川續(xù)斷提取物對空腸中CYP3A37、MDR1和CXR基因表達的影響

3 討論

藥物的相互作用(drug-drug interaction,DDI)指在一定時間內先后服用2種或2種以上藥物后所產(chǎn)生的復合效應，可使藥效加強或副作用減輕，也可使藥效減弱或出現(xiàn)不應有的毒副作用。其中，代謝性藥物相互作用是藥物動力學相互作用的核心，是藥物相互作用的重要環(huán)節(jié)。醫(yī)學研究領域的多個研究報告表明，各種中草藥會和許多處方藥發(fā)生相互作用[8]，如服用抗過敏藥物特非那定的患者同時飲用了抑制CYP3A4的葡萄柚汁導致特非那定中毒死亡[9]。貫葉連翹提取物能提高CYP3A4的表達量，而促進環(huán)孢霉素的代謝，血藥濃度降低,導致吸收減少。獸醫(yī)研究領域也開展了中獸藥與西藥間的相互作用研究，如楊靖、任偉龍[10-11]等研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的槲皮素影響恩諾沙星在肉雞體內的藥物動力學過程，造成達峰時間提前，達峰濃度及AUC降低；黃連素能顯著促進恩諾沙星在肉雞體內的吸收，減慢其排泄過程。本項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可增加氟苯尼考在大鼠體內的吸收，減緩代謝消除，提高口服生物利用度，黃芩苷對非索非那定的吸收有明顯促進作用[6,12]。但目前人們對中藥成分與CYP450作用的研究多集中在單個有效成分上,對成分復雜的單味藥提取物的研究很少，而在我國養(yǎng)殖業(yè)中，中草藥的利用大多是作為飼料原料或提取物在使用，因此開展中獸藥提取物對獸用專用化學藥品的聯(lián)合應用研究是有必要和有意義的。

本次試驗對肉雞每天灌胃給藥川續(xù)斷提取物(0.3 g/kg，1次/d)連續(xù)7 d，予以氟苯尼考灌服給藥后，藥物動力學參數(shù)結果發(fā)生明顯變化，Tmax減少，提示氟苯尼考的吸收速度增加，T1/2的增加和CL的減少，提示氟苯尼考在體內的代謝減緩，總的來說，川續(xù)斷提取物增加了氟苯尼考的在肉雞體內的吸收速度并減緩了代謝，最終造成AUC增加，提高了氟苯尼考在雞體內的生物利用度。

CYP450是人及畜禽體內重要的藥物代謝酶，參與大部分的藥物代謝，其中CYP3A4是人和動物肝臟中含量最豐富的CYP450酶，在雞體內以CYP3A37為主，參與臨床約50%的藥物代謝[13]，P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)在藥物吸收、分布、代謝及排泄方面有重要的作用[14]。雞異生物體受體(Chicken xenobiotic receptor,CXR)是一種存在于禽類、與核受體超家族成員具有相似典型結構與功能的核受體，是CYP450酶和MDR1基因表達的調控的關鍵因子[15-16]，氟苯尼考在雞體內的吸收代謝主要經(jīng)由MDR1和CYP3A37完成[17]，因此本試驗選擇這2個基因的mRNA表達量進行考察，發(fā)現(xiàn)川續(xù)斷提取物連續(xù)灌服7 d，對肉雞肝臟和空腸的CYP3A37 mRNA和MDR1 mRNA表達有明顯的抑制作用，對CXR mRNA表達也表現(xiàn)出顯著的下調作用，提示可能是川續(xù)斷提取物下調了CXR mRNA 表達，導致CYP3A37和P-gp mRNA的表達受到抑制，進而可能降低相對應的藥物代謝酶/轉運體酶活性，最終引起氟苯尼考在腸道吸收加快，代謝延緩，生物利用度增加，從而引起氟苯尼考藥物動力學特征改變。此外，藥物之間相互作用的關鍵因素除了主要涉及上述提及的CYP450 酶和藥物轉運體外，還涉及尿苷二磷酸、谷胱甘肽轉移酶等其他的藥物代謝酶[18]，同時和中草藥的劑量、給藥方案、給藥途徑和治療范圍、服藥時間長短等也有影響，這都需要開展進一步的研究。

綜上所述，川續(xù)斷提取物對氟苯尼考在雞體內的代謝有一定的影響，加快了氟苯尼考在體內的吸收速度和減緩了代謝，增加了氟苯尼考的生物利用度，提示臨床上兩者合用有潛在增效作用，可能原因是川續(xù)斷提取物抑制了肝臟和空腸的CYP3A37 mRNA和P-gp的mRNA表達，但獸醫(yī)臨床具體的藥效學結果有待進一步加以確證，以促進對川續(xù)斷全面的認識，以及為臨床合理用藥提供依據(jù)。