陳宇微，高 琛，楊志遠(yuǎn),王金泉,劉暢,3，郝智慧*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心，北京 100193;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島 266109)

抗菌藥物是目前我國(guó)畜牧養(yǎng)殖行業(yè)中使用最廣泛和最重要的抗感染藥物，在控制畜禽的傳染性疾病和提高畜禽的生產(chǎn)性能方面發(fā)揮著重要作用。但如果使用不當(dāng)，出現(xiàn)濫用等現(xiàn)象，會(huì)給畜禽及整個(gè)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)細(xì)菌耐藥以及藥物殘留等諸多問(wèn)題[1]。如今，細(xì)菌耐藥問(wèn)題在全球范圍內(nèi)普遍存在，多藥耐藥菌及全耐藥菌的檢出率居高不下，一些常用抗菌藥物因?yàn)榧?xì)菌耐藥問(wèn)題變得不敏感，而新藥研發(fā)進(jìn)程緩慢，尋找抗菌藥物的抗菌增效劑增加或增強(qiáng)或增敏其療效，能夠減少臨床抗菌藥物的使用量，提高抗菌藥物的使用效率已成為當(dāng)前流行的應(yīng)對(duì)策略[2-4]。目前已有大量通過(guò)抗菌藥物協(xié)同抗生素聯(lián)合抗菌的研究報(bào)道，如黃芩苷和環(huán)丙沙星、肉桂精油與氯霉素組合均對(duì)大腸埃希氏菌具有協(xié)同抑菌作用，且肉桂精油、玫瑰花精油、天竺葵精油等與鏈霉素、慶大霉素聯(lián)用對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌有協(xié)同或相加作用[5-7]。筆者通過(guò)針對(duì)臨床常用的12種抗菌藥物的抗大腸埃希氏菌增效劑進(jìn)行篩選，以丁香酚、尼泊金酯鈉、羧甲殼聚糖、沒(méi)食子酸酯和乙基麥芽酚5種可能的成分為目標(biāo)，確定其作為抗菌藥物針對(duì)大腸埃希氏菌的抗菌增效劑的可能性，期望能夠篩選出與抗菌藥物配伍使用具有較好的協(xié)同或相加增效的抗菌增效劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 沒(méi)食子酸甲酯、沒(méi)食子酸乙酯，成都瑞芬思生物科技有限公司產(chǎn)品；丁香酚、尼泊金酯鈉、羧甲殼聚糖、沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子酸丙酯、乙基麥芽酚等增效劑候選藥物及抗菌藥物，山東信德生物科技有限公司贈(zèng)送?？咕幬镄畔⒁姳?。

表1 抗菌藥物信息

1.1.2 菌株來(lái)源 大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株ATCC 25922，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB瓊脂、MH肉湯，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器 雙人單面垂直凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱(LRH-250F)、恒溫振蕩培養(yǎng)器(HZQ-X300C)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；自動(dòng)立式高壓滅菌器(GI80DS)，致微(廈門)儀器有限公司；十萬(wàn)分之一電子天平(BT125D)，賽多利斯公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗菌藥物的配制 以少量的溶劑(100 μL)溶解抗菌藥物及單體，再用稀釋劑稀釋終濃度含10 mL/L溶劑，配制終濃度為5 120 μg/mL藥物儲(chǔ)備液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后分裝到無(wú)菌2 mL離心管中，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備 用過(guò)夜培養(yǎng)的MH瓊脂培養(yǎng)皿上的單菌落，制備0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，用無(wú)菌MH肉湯100倍稀釋，即得到約含1.0×106CFU/mL的菌液。

1.2.3 大腸埃希氏菌MIC測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行測(cè)定[8]。

1.2.4 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)(FIC測(cè)定) 將各種藥物原液從2倍MIC濃度開始，取6個(gè)～8個(gè)濃度梯度使用滅菌MH肉湯倍比稀釋。取無(wú)菌96孔板，采用棋盤法，將不同濃度的2種藥物各取50 μL分別排列在96孔板的橫列和縱列中形成不同濃度組合的2種藥物混合液。在加藥的96孔板中每孔加入100 μL稀釋好的1.0 × 106CFU/mL大腸埃希氏菌懸液，混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h～16 h后觀察結(jié)果。

1.2.5 抑菌濃度指數(shù)FIC值計(jì)算 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果濃度指數(shù)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)，計(jì)算公式如下：

其中,FIC≤0.5為“協(xié)同作用”；0.5

2 結(jié)果

2.1 12種臨床常用抗菌藥物對(duì)大腸埃希氏菌體外抑菌MIC結(jié)果

通過(guò)觀察96孔板中培養(yǎng)物的透明度，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出慶大霉素、多西環(huán)素、金霉素、青霉素V、紅霉素、乳酸恩諾沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素、阿莫西林、壯觀霉素、黏桿菌素的MIC值分別為1、8、128、128、512、512、2 560、4、256、4、0.312 5、0.125 μg/mL。

2.2 抗菌增效劑候選物對(duì)大腸埃希氏菌的體外抑菌試驗(yàn)MIC結(jié)果

通過(guò)觀察96孔板中培養(yǎng)物的透明度，計(jì)算出8種單體的MIC，可知丁香酚、尼泊金酯鈉、羧甲殼聚糖、沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子酸甲酯、沒(méi)食子酸乙酯、沒(méi)食子酸丙酯和乙基麥芽酚對(duì)大腸埃希氏菌均有抑制作用，丁香酚、尼泊金酯鈉、羧甲殼聚糖、沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子酸甲酯、沒(méi)食子酸乙酯、沒(méi)食子酸丙酯和乙基麥芽酚對(duì)大腸埃希氏菌的MIC值分別為256、256、2、640、512、512、512、5 120 μg/mL。

2.3 聯(lián)合作用比較

2.3.1 丁香酚與抗菌藥物聯(lián)合作用 由表2可知，丁香酚與慶大霉素、金霉素、乳酸恩諾沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素、黏桿菌素聯(lián)合作用均具有協(xié)同作用，其中丁香酚與金霉素的協(xié)同作用最強(qiáng)。丁香酚與紅霉素聯(lián)用具有相加作用；與多西環(huán)素和壯觀霉素聯(lián)用呈無(wú)關(guān)作用而與青霉素V和阿莫西林具有拮抗作用。

2.3.2 尼泊金酯鈉和抗菌藥物聯(lián)合作用 由表2的結(jié)果可以看出尼泊金酯鈉與金霉素、乳酸恩諾沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素均具有協(xié)同作用，其中尼泊金酯鈉與氟苯尼考的協(xié)同作用最強(qiáng)。尼泊金酯鈉與慶大霉素、多西環(huán)素、紅霉素、阿莫西林、黏桿菌素聯(lián)用具有相加作用；與壯觀霉素具有無(wú)關(guān)作用而與青霉素V具有拮抗作用。

2.3.3 羧甲殼聚糖和抗菌藥物聯(lián)合作用 由表2的結(jié)果可以看出羧甲殼聚糖與慶大霉素、多西環(huán)素、紅霉素、乳酸恩諾沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素均具有協(xié)同作用，其中羧甲殼聚糖與乳酸恩諾沙星的協(xié)同作用最強(qiáng)。羧甲殼聚糖與金霉素、青霉素V、阿莫西林、壯觀霉素聯(lián)用具有相加作用；與黏桿菌素具有無(wú)關(guān)作用。

2.3.4 沒(méi)食子酸酯和抗菌藥物聯(lián)合作用 由表2可知，沒(méi)食子酸酯與多西環(huán)素、金霉素、紅霉素、乳酸恩諾沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素均具有協(xié)同作用，其中沒(méi)食子酸酯與林可霉素的協(xié)同作用最強(qiáng)。沒(méi)食子酸酯與壯觀霉素和黏桿菌素聯(lián)用具有相加作用；與青霉素V、阿莫西林、和壯觀霉素具有無(wú)關(guān)作用,而沒(méi)食子酸酯與慶大霉素聯(lián)用具有拮抗作用。

2.3.5 乙基麥芽酚和抗菌藥物聯(lián)合作用 由表2的結(jié)果可以看出乙基麥芽酚與慶大霉素、多西環(huán)素、金霉素、紅霉素、乳酸恩諾沙星、林可霉素、泰妙菌素均具有協(xié)同作用，其中乙基麥芽酚與金霉素的協(xié)同作用最強(qiáng)。乙基麥芽酚與壯觀霉素和黏桿菌素聯(lián)用具有相加作用。

表2 抗菌增效劑和抗菌藥物聯(lián)用指數(shù)(FIC)結(jié)果

3 討論

本研究所選取的氟苯尼考等12種抗菌藥物都是臨床大腸桿菌病常用抗菌藥物，都存在著一定程度的耐藥性問(wèn)題，在臨床實(shí)踐中已有發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌對(duì)青霉素和紅霉素不敏感的現(xiàn)象[9]，甚至部分雞場(chǎng)還檢測(cè)到對(duì)青霉素耐藥的情況，同時(shí)禽致病性大腸埃希氏菌對(duì)金霉素也有嚴(yán)重的耐藥性[10]。除此之外，豬源大腸埃希氏菌對(duì)金霉素、多西環(huán)素等四環(huán)素類抗菌藥物均有著嚴(yán)重的耐藥性[11]，臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)豬源腸球菌對(duì)氟苯尼考也出現(xiàn)了耐藥性[12]。不僅國(guó)內(nèi)有大腸埃希氏菌對(duì)抗菌藥物耐藥的報(bào)道，國(guó)外也有研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌已出現(xiàn)明顯的耐藥性[13]。因此，在抗菌藥物耐藥性日益嚴(yán)重的情況下，解決抗菌藥物的耐藥性問(wèn)題就顯得非常重要。研究表明恩諾沙星和慶大霉素與中藥單體聯(lián)用對(duì)仔豬大腸埃希氏菌引起的腹瀉比單藥使用有更高的治愈率[14]，說(shuō)明恩諾沙星和慶大霉素等抗菌藥物在與增效劑聯(lián)用的情況下能明顯的增強(qiáng)抗菌藥物療效，而硒化甘草多糖聯(lián)合抗菌藥物的研究也表明中藥單體能夠減少抗菌藥物的使用劑量[15]。同時(shí)，國(guó)外研究者發(fā)現(xiàn)精油等化合物與抗菌藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用[16]，也證實(shí)了中藥單體作為增效劑的可行性。通過(guò)MIC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)丁香酚、尼泊金酯鈉、羧甲殼聚糖、沒(méi)食子酸酯和乙基麥芽酚等抗菌增效劑候選物均有一定的抑菌作用，且與所針對(duì)的抗菌藥物聯(lián)用具有很好的協(xié)同或相加作用。本文所選的丁香酚所展現(xiàn)的抑菌作用與錢衛(wèi)東等[17]研究發(fā)現(xiàn)的抗菌活性相一致。尼泊金酯鈉常用作食品防腐劑，其抑菌作用與鄧明玉等[18]對(duì)尼泊金酯抑菌性能的研究相符，表明尼泊金酯鈉不僅僅可以用作防腐劑，也可以考慮與抗菌藥物聯(lián)用減輕抗菌藥物的用量。眾所周知，殼聚糖具有抑菌作用，常用于對(duì)織物進(jìn)行抑菌防霉整理和在食品行業(yè)作為天然保鮮劑[19]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼聚糖衍生物羧甲殼聚糖也具有抑菌作用，且其對(duì)大腸埃希氏菌的抑制效果突出。沒(méi)食子酸鹽類物質(zhì)的抑菌作用已被多數(shù)研究者進(jìn)行報(bào)道，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸酯也具有抑菌效果，且能夠和多西環(huán)素、金霉素、紅霉素、乳酸恩諾沙星、林可霉素、氟苯尼考、泰妙菌素等抗菌藥物具有很好的協(xié)同抑制大腸埃希氏菌作用。乙基麥芽酚是一種安全、可靠、用量少、效果顯著的食品添加劑，常被用于食品的增甜效果。乙基麥芽酚對(duì)大腸埃希氏菌具有抑菌作用，但是相比其他的單體其抑制作用較弱。然而，乙基麥芽酚具有很好的聯(lián)合性，與多種抗菌藥物聯(lián)用對(duì)大腸埃希氏菌均有較強(qiáng)的抑制作用，且其與慶大霉素、多西環(huán)素、金霉素、紅霉素、乳酸恩諾沙星、林可霉素、泰妙菌素的FIC指數(shù)差異不大，與乙基麥芽酚的協(xié)同抑菌機(jī)制是否有關(guān)還需要進(jìn)一步的研究。

根據(jù)FIC指數(shù)發(fā)現(xiàn)同一單體對(duì)不同類型抗菌藥物的協(xié)同抑菌作用具有較大的差異。如丁香酚與黏桿菌素，尼泊金酯鈉與林可霉素，羧甲殼聚糖與多西環(huán)素，乙基麥芽酚與阿莫西林的FIC指數(shù)均顯著高于同一單體與其他抗菌藥物聯(lián)用的FIC指數(shù)?？赡芘c不同類型抗菌藥物的作用機(jī)制有關(guān)，抗菌藥物的抑菌機(jī)制不同，從而引起單體的增效機(jī)制不同，這一發(fā)現(xiàn)還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。且同一抗菌藥物對(duì)不同單體的聯(lián)合作用也有明顯差異。如阿莫西林與丁香酚聯(lián)用時(shí)具有拮抗作用，與沒(méi)食子酸酯聯(lián)用具有無(wú)關(guān)作用，而與尼泊金酯鈉和羧甲殼聚糖聯(lián)用則具有相加作用，與乙基麥芽酚聯(lián)用則具有協(xié)同作用。因此，不同單體對(duì)不同的抗菌藥物的協(xié)同或相加作用的作用機(jī)理是非常值得探討的。

丁香酚、尼泊金酯鈉、羧甲殼聚糖、沒(méi)食子酸酯、乙基麥芽酚均具有較好的增效作用。丁香酚與檢測(cè)的12種抗菌藥物中8種抗菌藥物具有協(xié)同或相加作用；尼泊金酯鈉與檢測(cè)的12種抗菌藥物中的10種具有協(xié)同或相加作用；羧甲殼聚糖與檢測(cè)的12種抗菌藥物中的11種具有協(xié)同或相加作用；沒(méi)食子酸酯和乙基麥芽酚分別與檢測(cè)的12種抗菌藥物中的9種、12種具有協(xié)同或相加作用。5種增效劑均與金霉素、乳酸恩諾沙星、林可霉素、泰妙菌素有協(xié)同作用。丁香酚、尼泊金酯鈉、羧甲殼聚糖、沒(méi)食子酸酯、乙基麥芽酚可以作為抗大腸埃希氏菌類抗菌藥物的抗菌增效劑使用，在臨床抗菌藥物聯(lián)合選擇中優(yōu)先被考慮，降低抗菌藥物在臨床抗大腸埃希氏菌感染的用量。