翁宇航， 熊清芳， 劉杜先， 張胥磊， 楊永峰

南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院(南京市第二醫(yī)院) 肝病科， 南京 210003

進行性家族性肝內膽汁淤積癥(progressive familial intrahepatic cholestasis，PFIC)是由基因缺陷引起的肝內膽汁淤積性疾病，因發(fā)病率極低，其流行病學、發(fā)病機制、臨床特征、診斷、治療、預后等方面的研究尚不充分[1]。PFIC共有6種臨床類型，其中1～3型居多，國外文獻報道1型和2型以嬰幼兒期發(fā)病為主，3型以青少年或成人發(fā)病為主[2]。PFIC 3型(PFIC3)發(fā)病是由于ABCB4(ATP-binding cassette B4)基因突變，其編碼的多耐藥蛋白3(multidrug resistance protein 3，MDR3)表達下調或功能障礙所致[3]，該基因突變還可引起妊娠期肝內膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)及低磷脂相關性膽石癥(low phospholipid-associated cholelithiasis，LPAC)?？紤]到PFIC3為罕見病，且目前可用的臨床資料較少。本文回顧性分析PFIC3患者臨床病理特征，以豐富國內PFIC3臨床資料。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2017年1月—2019年12月于本院就診的1326例不明原因肝病患者的臨床資料。不明原因肝病指無誘因持續(xù)或反復肝功能生化指標異常，或肝臟影像學檢查異常6個月以上，通過常規(guī)病史詢問、體格檢查和實驗室檢查仍不能明確病因的肝病[4]。

1.2 納入與排除標準 所有不明原因肝病患者均住院行肝組織穿刺，最終有218例患者在肝組織病理檢查后仍不能明確病因的行二代測序全外顯子檢查?；蚪MDNA由EDTA抗凝的外周靜脈血細胞獲得，ABCB4突變檢測采用遺傳性膽汁淤積相關基因的Panel進行二代測序[5]，對發(fā)現(xiàn)的突變位點進行Sanger測序驗證[6]。診斷標準中，膽汁淤滯持續(xù)超過6個月考慮慢性膽汁淤積[7]，肝硬化診斷參考2019年《肝硬化診治指南》[8]。PFIC3目前尚無明確的診斷標準，診斷依據(jù)臨床表現(xiàn)、檢驗、影像、肝組織學及基因檢查。臨床表現(xiàn)為慢性膽汁淤積，基因檢測發(fā)現(xiàn)ABCB4致病突變的患者考慮PFIC3[9]。

1.3 資料收集 最終納入PFIC3患者8例，其中1例因禁忌證未行肝組織穿刺，后經二代測序確診為PFIC3。收集所有PFIC3患者的一般情況、臨床癥狀體征、化驗、影像、肝穿刺病理檢查等資料進行分析。

1.4 肝組織活檢 常規(guī)肝組織針刺活檢，取長1.5～2 cm，直徑0.1～0.2 cm肝組織，10%福爾馬林固定、酒精脫水、石蠟包埋、HE染色，CK7免疫組化、目的蛋白用抗ABCB4(克隆P3Ⅱ-26，Thermo)對4 mm厚的石蠟切片孵育，后用多聚辣根過氧化物酶抗小鼠IgG，以二氨基聯(lián)苯胺顯色底物，并以正常肝和ABCB4缺乏癥肝組織切片作為陰性和陽性對照。炎癥分級(G)和纖維化分期(S)評分采用朔伊爾評分[10]。膽管損傷指小葉間膽管炎癥浸潤或膽管上皮損傷，包括膽管細胞腫脹、壞死、萎縮、退化等[11]；膽管減少是10個以上完整匯管區(qū)中，20%～50%肝動脈無小葉間膽管伴行[12]；膽管缺失是10個以上完整匯管區(qū)中，超過50%肝動脈無小葉間膽管伴行[13]。病理切片由臨床醫(yī)生和病理醫(yī)師共同讀片判定。

1.5 文獻回顧 檢索PubMed數(shù)據(jù)庫，檢索表達式為：(ABCB4[TI] OR MDR3[TI] OR Progressive familial intrahepatic cholestasis type 3[TI]) AND (histolog* OR patholog* OR Histopath* OR biops*)，在檢索結果中排除綜述和非臨床研究文獻，最終納入含有ABCB4病理描述和/或MDR3免疫組化的臨床文獻，對所有確診為LPAC、 ICP、PFIC3患者的病理描述進行分析。

1.6 倫理學審查 本研究經南京市第二醫(yī)院倫理委員會批準，批號： 2021-LY-kt052。

2 結果

2.1 一般資料 8例確診PFIC3均為成年患者，其中男性占62.5%(5/8)，女性占37.5%(3/8)。年齡最小18歲，最大54歲，中位年齡29.5歲。

2.2 臨床表現(xiàn) 本研究隊列中，50%(4/8)病例表現(xiàn)為慢性膽汁淤積；50%(4/8)病例表現(xiàn)膽汁性肝硬化，肝硬化病例中75%(3/4)合并顯著的門靜脈高壓表現(xiàn)(表1)。

2.3 實驗室檢查 實驗室數(shù)據(jù)均取自患者入院以來的極值(最小值～最大值)。所有患者肝功能指標均異常，ALT、AST均有不同程度地升高，87.5%(7/8)患者TBil升高，25%(2/8)患者出現(xiàn)低白蛋白血癥，膽汁淤積相關指標明顯升高，75%(6/8)患者ALP升高，100%(8/8)患者GGT升高，指標中以GGT升高最為明顯；25%(2/8)患者表現(xiàn)為紅細胞(RBC)降低，12.5%(1/8)患者白細胞(WBC)增高，25%(2/8)患者表現(xiàn)為凝血功能異常(表2)。

表1 8例PFIC3患者臨床特征

表2 8例PFIC3患者實驗室檢查

2.4 影像學檢查 50%(4/8)患者合并膽囊炎，25%(2/8)患者合并膽囊結石，25%(2/8)患者膽管擴張，75%(6/8)患者脾臟腫大，25%(2/8)患者出現(xiàn)肝硬化表現(xiàn)(表1)。

2.5 病理表現(xiàn) PFIC3患者肝穿刺病理表現(xiàn)見表3和圖1。7例患者均表現(xiàn)程度不同的炎癥及纖維化，炎癥以匯管區(qū)為主，3例(42.9%)伴輕度界面炎(G2)。纖維增生以匯管區(qū)為主，4例(57.1%)可見匯管-匯管為主的橋接纖維化(S3)，其中3例(42.9%)可見不同程度的假小葉形成(S4)。膽管損傷是突出的病理改變，7例患者均可見不同程度膽管病變，表現(xiàn)膽管上皮炎細胞浸潤、膽管上皮細胞缺失、排列紊亂等膽管損傷表現(xiàn)；3例(42.9%)表現(xiàn)小葉間膽管數(shù)量減少，其他4例(57.1%)表現(xiàn)小葉間膽管缺失。膽管缺失病例CK7免疫組化可見匯管區(qū)周圍肝細胞陽性，提示肝細胞淤膽。MDR3免疫組化3例(42.9%)呈基本正常的肝細胞毛細膽管面表達，4例(57.1%)MDR3表達減少。

2.6 ABCB4突變檢測 采用遺傳性膽汁淤積相關基因的Panel進行二代測序，8例PFIC3患者均檢測到ABCB4基因突變。5例檢測到1個突變，為雜合突變；3例檢測到2個突變，為復合雜合突變。ABCB4突變位點文獻[14-16]報道有1個為已知變異，余下6個未知變異通過生物信息學軟件分析提示可能致病(表1)。目前正在做體外功能驗證，磷脂分泌初步實驗結果提示也是致病的，因內容較多在此不具體敘述。

表3 PFIC3患者組織病理學及免疫組化染色特征

注：a，病例2匯管區(qū)小葉間膽管可見上皮細胞缺失，膽管損傷(HE染色，×400)；b，病例4匯管區(qū)纖維增生，未見和小葉間動脈伴行的小葉間膽管，膽管缺失(HE染色，×200)；c，病例1以匯管區(qū)為中心的纖維增生形成假小葉(Masson染色，×100)；d，病例7 顯示一個較大的匯管區(qū)膽管缺失，界面處可見細膽管，部分肝細胞CK7表達(免疫組化，×200)；e，病例2 MDR3沿肝細胞毛細膽管面表達，表達量基本正常(免疫組化，×400)；f，病例6約20%肝細胞毛細膽管面MDR3表達，表達明顯減少，部分肝細胞漿MDR3弱表達(免疫組化，×400)。圖1 PFIC3患者肝組織病理表現(xiàn)

2.7 ABCB4相關疾病病理文獻回顧 在PubMed數(shù)據(jù)庫檢索，按照本文1.5表達式檢索，其中符合表達式的文獻共有98篇。排除綜述和非臨床研究文獻，納入含有病理膽管描述和/或MDR3免疫組化的文獻17篇。病理描述文獻中，7例LPAC膽管正常占71.4%(5/7)，膽管減少占14.3%(1/7)，膽管缺失占14.3%(1/7)；6例ICP膽管正常占16.7%(1/6)，膽管減少占50%(3/6)，膽管缺失占33.3%(2/6)；8例PFIC3膽管減少占25%(2/8)，膽管缺失占75%(6/8)。MDR3免疫組化文獻中1例LPAC患者為正常表達；21例PFIC3正常表達占9.5%(2/21)，表達減少患者占23.8%(5/21)，表達缺失占66.7%(14/21)。病理文獻結果詳見表4。

3 討論

PFIC是一組罕見疾病，通常發(fā)生在嬰兒期和兒童期，目前已報道6種類型，其中ABCB4基因缺陷可導致PFIC3。ABCB4基因編碼磷脂轉運蛋白MDR3，該基因缺陷可以引起MDR3轉運障礙，磷脂不能被轉運到膽汁中。生理情況下，膽汁中磷脂、膽鹽、膽固醇比例適中。當磷脂比例減少時，膽鹽和膽固醇占比升高，膽鹽破壞膽管，膽固醇淤積從而致病[34]。ABCB4基因突變還可以引起ICP及LPAC等疾病，但嚴重程度相比PFIC3較輕。

表4 ABCB4突變患者病理特征文獻[17-33]回顧

PFIC3目前在國內流行狀況不明。患者通常在嬰兒晚期(約三分之一的病例)至青春期出現(xiàn)膽汁淤積，輕者表現(xiàn)為無黃疸的慢性膽汁淤積癥，重者可進展至門靜脈高壓、肝硬化和肝衰竭。由于該病起病隱匿，肝硬化和消化道出血可能是兒童或成年階段首發(fā)癥狀?；颊甙l(fā)生膽固醇結石的風險也有所增加[35]。體征包括黃疸、肝腫大。本隊列中8例患者占同期不明原因肝病患者的0.6%(8/1326)，中位年齡為29.5歲，患者均表現(xiàn)為長期慢性膽汁淤積，嚴重者表現(xiàn)膽汁性肝硬化，可出現(xiàn)黃疸、門靜脈高壓、食管胃靜脈曲張出血等癥狀，符合文獻報道結果?；颊甙l(fā)病年齡及疾病嚴重程度各異，可能是突變致病性不同或與個體差異性有關。

PFIC3患者實驗室檢查以膽汁淤積為主，通常GGT和ALP增高[36]，可伴有氨基轉移酶等炎癥指標增高。當出現(xiàn)肝硬化時，可出現(xiàn)黃疸、低白蛋白血癥、凝血功能異常[9]。本隊列患者均有明顯的膽汁淤積，表現(xiàn)為膽酶(GGT、ALP)顯著升高，其中GGT升高明顯；其他亞型(1型、2型、4型、5型、6型)家族性膽汁淤積癥均表現(xiàn)低GGT膽汁淤積，有助于臨床鑒別?；颊?、6有肝硬化表現(xiàn)，如凝血功能異常及低白蛋白血癥。

影像方面超聲是一項最基本的檢查，除了部分PFIC3病例存在膽結石外，它還有助于排除其他梗阻性原因引起的膽汁淤積。磁共振膽道成像可清晰顯示膽管結構，有助于本病鑒別診斷。本隊列中，患者多伴有膽囊炎、膽囊結石、膽管擴張，這符合PFIC3的病理生理學特點。一方面膽固醇等物質析出容易造成結石；另一方面，結石以及反復的膽管損傷可能造成膽管、膽囊炎癥，進而膽管擴張，嚴重者也可有膽汁性肝硬化。

肝組織學對診斷非常重要。在PFIC3中，組織學表現(xiàn)除炎癥及纖維化等非特異性病理改變外[37]，膽管損傷是該病的主要病理特征，且隨病情加重，可出現(xiàn)膽管缺失[38-39]。根據(jù)文獻回顧結果，ICP及LPAC病理多表現(xiàn)為膽管正常或減少，而PFIC3多表現(xiàn)為膽管缺失，缺失數(shù)量較多者往往預后較差，此類患者多表現(xiàn)肝硬化或在早期行肝移植治療。以上結果提示臨床表型越重，膽管缺失比例也越高。本隊列所有病例均表現(xiàn)膽管損傷伴膽管減少或膽管缺失，且纖維分期S3以上病例均表現(xiàn)膽管缺失，提示膽管損傷程度與疾病嚴重程度有關。MDR3表達在PFIC3中可以表現(xiàn)為正常、減少或缺失[40-41]。雖然MDR3表達減少或缺失有助于診斷，但正常表達并不排除PFIC3的診斷。因為突變可能導致MDR3功能喪失，但仍可以正常合成和定位[42]，本隊列中57.1%(4/7)病例MDR3表達減少，42.9%(3/7)病例MDR3表達正常，且MDR3表達和病情輕重無相關性。因此MDR3免疫組化結果正常時仍不能排除診斷，必要時需基因檢測進一步確認。

總之，不明原因慢性或反復伴GGT升高的膽汁淤積的患者，需考慮PFIC3可能；LPAC病史和家族史支持本病診斷，超聲、磁共振、CT等影像檢查有助于鑒別診斷和病情評估；膽管損傷/缺失伴不同程度的炎癥、纖維化是該病的病理特征；MDR3免疫組化顯示表達減少或缺失有助于診斷，但MDR3表達正常也不能排除該?。辉摬〉拇_診仍有賴于基因檢測，加強臨床和基因檢測實驗室之間的溝通至關重要。由于PFIC3發(fā)病罕見，未來需多中心的臨床隊列研究和基礎研究，以進一步明確該病的臨床特征、診斷和治療方案。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：翁宇航負責收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫論文；熊清芳、劉杜先、張胥磊指導撰寫文章；楊永峰負責課題設計，擬定寫作思路，修改論文并最后定稿。