秦丹鳳， 胡曉峰， 陳慶青， 李 濱， 張 靜， 王岳鵬， 唐 奇

上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院崇明分院 急診科，上海 202150

哮喘為炎癥性呼吸道疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與上皮細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等共同參與及氣道黏膜局部的T細(xì)胞群活化，造成Th1/Th2細(xì)胞失衡有關(guān)[1]。國(guó)外研究表明，哮喘患者Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化，分泌更多的2型固有淋巴細(xì)胞(type 2 innate lymphocytes，ILC2)相關(guān)細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-5、IL-13、IL-33等參與哮喘發(fā)病[2]。Rac1是Rho超家族成員的Rac亞家族，在各組織中均有表達(dá)，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，發(fā)揮多樣生物學(xué)功能，包括細(xì)胞的增殖與凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移、血管生成等[3]。氣道炎癥是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵，炎癥因子表達(dá)與氣道炎癥嚴(yán)重程度關(guān)系密切[4]。國(guó)外研究表明，哮喘患者的血清Rac1異常表達(dá)，Rac1可通過(guò)對(duì)免疫的調(diào)節(jié)參與哮喘發(fā)病，且與氣道炎癥反應(yīng)有關(guān)[5]。但國(guó)內(nèi)相關(guān)研究少見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討哮喘患者血清Rac1的表達(dá)水平及其與氣道炎癥的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2020年4月至2021年4月上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院崇明分院收治的57例哮喘患者作為哮喘組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《支氣管哮喘防治指南》[6]中哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)無(wú)肺部手術(shù)史；(3)年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)職業(yè)性哮喘者；(2)伴嚴(yán)重高血壓、糖尿病等慢性疾病者；(3)伴呼吸道感染、慢性阻塞性肺病、肺結(jié)核等其他呼吸系統(tǒng)疾病者；(4)有酗酒史者。另選取同期于本院進(jìn)行體檢的57例健康體檢者作為健康組。哮喘組中，男性30例，女性27例；年齡20～58歲，平均(40.08±6.11)歲；病程3～10年，平均(5.45±1.40)年；體質(zhì)量指數(shù)18～26 kg/m2，平均(21.23±1.12)kg/m2。健康組中，男性32例，女性25例；年齡22～59歲，平均(39.47±6.47)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～25 kg/m2，平均(21.06±1.04)kg/m2。兩組研究對(duì)象性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞Rac1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采集研究對(duì)象晨起空腹肘靜脈血，置于EDTA抗凝管中，3 000 r/min離心10 min后除去血漿。采用定量RT-PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中Rac1 mRNA表達(dá)水平。采用Ficoll密度梯度分離法分離單核細(xì)胞，裂解后提取蛋白，制成細(xì)胞懸液。加200 μl預(yù)冷氯仿，混勻后靜置10 min。離心后吸取400 μ上層水，加500 μl異丙醇后混勻，再次離心。去上清后加1 ml的75%乙醇，混勻后離心，去掉上層液體后吹干。加10 μl的DEPC水，充分溶解RNA。配制逆轉(zhuǎn)錄體系，加入后混勻，放在PCR儀操作：85℃下5 s，37℃下15 min，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Rac1引物設(shè)計(jì)：上游：5′-GTAAAACCTGCCTGCTCATCA-3′，下游：5′-GGACGCAATCTGTCATAATCTTC-3′。配制定量PCR體系，加入后混勻，置于定量PCR儀上操作：95℃下5 min預(yù)變性，95℃下10 s變性，30 s退火，72℃下1 min延伸。根據(jù)所測(cè)Ct值采用相對(duì)定量分析法計(jì)算測(cè)試基因2-△△Ct，所有樣本孔重復(fù)測(cè)3次。

1.2.2 血清炎癥因子表達(dá)水平檢測(cè) 采集患者3 ml空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min后留取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定血清白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-5、IL-13、IL-33。

1.2.3 哮喘嚴(yán)重程度 參考美國(guó)胸科學(xué)會(huì)的指導(dǎo)方針，1 s用力呼氣容積≥80%為輕度，60%～79%為中度，1 s用力呼氣容積<60%為重度。比較不同哮喘嚴(yán)重程度患者PBMC中Rac1 mRNA表達(dá)水平及血清IL-5、IL-13、IL-33水平。

2 結(jié)果

2.1 哮喘組與健康組Rac1 mRNA及血清炎癥因子水平比較 哮喘組Rac1 mRNA表達(dá)低于健康組，血清IL-5、IL-13、IL-33水平高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 不同嚴(yán)重程度哮喘患者Rac1 mRNA及血清炎癥因子水平比較 不同嚴(yán)重程度哮喘患者Rac1 mRNA表達(dá)及血清IL-5、IL-13、IL-33水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中度組與重度組Rac1 mRNA表達(dá)低于輕度組，且重度組低于中度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中度組與重度組血清IL-5、IL-13、IL-33水平高于輕度組，且重度組高于中度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 哮喘患者Rac1 mRNA表達(dá)與血清炎癥因子水平相關(guān)性分析 哮喘患者Rac1 mRNA表達(dá)與血清IL-5、IL-13、IL-33呈明顯負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.797、-0.558、-0.547，P<0.001)。見(jiàn)圖1～3。

圖1 Rac1 mRNA表達(dá)與血清IL-5相關(guān)性散點(diǎn)圖 圖2 Rac1 mRNA表達(dá)與血清IL-13相關(guān)性散點(diǎn)圖 圖3 Rac1 mRNA表達(dá)與血清IL-33相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

本研究結(jié)果顯示，與健康人群相比，哮喘患者PBMC中Rac1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，且隨著哮喘嚴(yán)重程度的增加而逐漸下降，提示PBMC中Rac1 mRNA表達(dá)的下調(diào)與哮喘發(fā)病有關(guān)。Rac1基因具有GTPase酶活性作用，可結(jié)合三磷酸鳥(niǎo)苷核苷酸后作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子調(diào)控GTPase酶的活性，通過(guò)激活或失活酶活性發(fā)揮Rac1的生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、參與腫瘤發(fā)病等[7]。有研究表明，氣道上皮細(xì)胞可通過(guò)吞噬凋亡上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子，而這一過(guò)程需Rac1的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路[8]。Rac1具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，可激活絲裂原活化蛋白激酶系統(tǒng)，促使胞外信號(hào)調(diào)控激酶轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，從而改變某些轉(zhuǎn)錄因子的活性[9]。此外，T細(xì)胞是支氣管哮喘發(fā)病的重要效應(yīng)細(xì)胞，而磷脂酰肌醇-3-激酶是T細(xì)胞的重要信號(hào)傳導(dǎo)分子。Rac1可通過(guò)對(duì)該信號(hào)傳導(dǎo)分子的調(diào)控作用參與Th1/Th2失衡、嗜酸粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞粘附等過(guò)程，進(jìn)而參與氣道炎癥反應(yīng)。

IL-33及其受體生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞，因此，IL-33所引起的氣道炎癥是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵之一[10]。有研究表明，哮喘患者和哮喘小鼠模型中血清IL-33水平均出現(xiàn)異常高表達(dá)[11]。動(dòng)物試驗(yàn)表明，小鼠腹腔注射IL-33或轉(zhuǎn)基因過(guò)度表達(dá)IL-33可觀察到氣道高反應(yīng)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[12]。注射IL-33會(huì)促進(jìn)固有Ⅱ型細(xì)胞的增加，分泌IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等的浸潤(rùn)，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)[13]。國(guó)外研究則發(fā)現(xiàn)，在抗原刺激的小鼠氣道上皮細(xì)胞中，Rac1的缺乏會(huì)使血清IL-33水平增加3倍，提示Rac1表達(dá)的下降對(duì)IL-33的調(diào)節(jié)作用是哮喘發(fā)病的機(jī)制之一，這也是PBMC中Rac1 mRNA表達(dá)與血清IL-33呈顯著負(fù)相關(guān)的主要原因[14]。此外，本研究中，哮喘患者血清IL-5、IL-13也出現(xiàn)異常升高，且隨著哮喘嚴(yán)重程度的增加呈逐漸升高的趨勢(shì)，提示IL-5、IL-13也是引起氣道炎癥的主要細(xì)胞因子。國(guó)外研究表明，ILC2可表達(dá)ST2(IL-33R)和IL-17RB(IL-25R)，受到IL-25或IL-33大幅升高的刺激時(shí)可誘導(dǎo)血清IL-5、IL-13的大量分泌[15]。ILC2在固有免疫應(yīng)答與Th2型免疫應(yīng)答間發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與哮喘發(fā)病及病情進(jìn)展[16]。IL-33誘導(dǎo)ILC2的固有免疫應(yīng)答在哮喘時(shí)顯著上調(diào)，是哮喘的免疫病理特征，促進(jìn)了血清IL-5與IL-13異常升高。哮喘患者血清IL-5及IL-13變化趨勢(shì)與IL-33保持一致，而Rac1表達(dá)下降會(huì)促進(jìn)血清IL-33水平升高，因此，PBMC中Rac1 mRNA表達(dá)也與血清IL-5與IL-13呈顯著負(fù)相關(guān)。但Rac1影響血清IL-33、IL-5與IL-13水平的相關(guān)信號(hào)通路及所涉及的調(diào)控因子尚不明確，仍有待更進(jìn)一步的體外研究證實(shí)。

綜上所述，Rac1可調(diào)控哮喘的免疫病理過(guò)程，哮喘發(fā)病后Rac1呈低表達(dá)，刺激血清IL-33的增加，同時(shí)刺激ILC2活化，促進(jìn)IL-5、IL-13分泌，且PBMC中Rac1 mRNA表達(dá)與血清IL-33、IL-5、IL-13均呈負(fù)相關(guān)。