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        人參皂苷對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡影響及作用機(jī)制

        2022-02-12 03:00:56張宇辰沈繼春曲雅靜徐朋朋
        臨床軍醫(yī)雜志 2022年1期
        關(guān)鍵詞:活性氧皂苷癌細(xì)胞

        張宇辰, 沈繼春, 曲雅靜, 徐朋朋

        武警特色醫(yī)學(xué)中心 1.腫瘤科;2.內(nèi)分泌與血液科,天津 300162

        肺癌是目前全世界發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康[1]。在我國(guó),肺癌的發(fā)病率及死亡率也居于惡性腫瘤首位[2],很多患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于晚期,錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī),無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療,常規(guī)放療和化療效果也不佳,導(dǎo)致5年生存率低。肺癌細(xì)胞的無(wú)限增殖、轉(zhuǎn)移及對(duì)化療藥物的耐藥是影響治療效果和患者生存率的重要因素。近年來(lái),隨著診斷和檢測(cè)水平的不斷提高,肺癌的發(fā)病機(jī)制在分子水平研究不斷加深,關(guān)鍵的信號(hào)調(diào)控通路異常與肺癌的發(fā)生具有密切關(guān)系已被證實(shí)。Keap1/Nrf2信號(hào)通路是一條重要的抗氧化保護(hù)性通路,主要包括Keap1、Nrf2及抗氧化反應(yīng)原件ARE[3]。有研究表明,人類(lèi)肺癌組織中存在Keap1、Nrf2/ARE基因突變[4],導(dǎo)致肺癌Keap1-Nrf2/ARE通路活化,參與肺癌的生物學(xué)行為,包括減少癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、介導(dǎo)癌細(xì)胞耐藥等[5]。人參皂苷是人參的主要活性成分,具有抗炎、抗過(guò)敏、抗衰老、保護(hù)神經(jīng)等藥理作用[6-8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),人參皂苷可以減少癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡,抑制癌細(xì)胞血管生成[9-11]。本研究旨在探討人參皂苷Rg3對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H292細(xì)胞增殖、凋亡的作用及其與相關(guān)信號(hào)通路Keap1-Nrf2/ARE的關(guān)系?,F(xiàn)報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 試劑與儀器 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H292購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞細(xì)胞庫(kù);人參皂苷Rg3購(gòu)自上海葉源生物公司;胎牛血清、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;青霉素鏈霉素雙抗、PBS胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone公司;CCK8增殖試劑盒購(gòu)自上海貝博生物技術(shù)公司;活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司;基因引物由上海生工科技有限公司合成;TH4-200型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司),流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter Altra公司)。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPM11640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),定期更換培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底面積80%,加入胰酶消化并傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

        1.3 CCK-8增殖 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞,以2×104每孔的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中,置于37 ℃溫箱中培養(yǎng),設(shè)立對(duì)照組(人參皂苷組0 μmol/L)、人參皂苷組(20、40、60 μmol/L),培養(yǎng)24 h后,按以下公式計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間(doubling time,DT)。每孔加入20 μl的CCK-8溶液,避光孵育30 min。采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各個(gè)孔的吸光度,檢測(cè)增殖能力。

        DT=細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間×log2/log(最終細(xì)胞數(shù)量/初始細(xì)胞數(shù)量)

        1.4 細(xì)胞凋亡能力 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞,加入人參皂苷Rg3(0、20、40、60 μmol/L)作用24 h后,PBS洗滌細(xì)胞3次后胰酶消化并收集細(xì)胞,離心后棄去上清,加入5 μl的Annexin V-FITC染液,混勻后再加入10 μl的碘化丙啶染色,混勻。37 ℃下靜置4 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

        1.5 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá) 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞,加入人參皂苷Rg3(0、20、40、60 μmol/L)作用24 h后,按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行RNA提取并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定Keap1、Nrf2的表達(dá)量。Keap1:上游3’-TTCAAGCCGCAGTTGCTCA-5’,下游3’-TTAGTCACCAGCGGGACG-5’。Nrf2:上游3’-GACTCTACCACTGTTCCCAA-5’,下游3’-CCATTCTTATTTCACCGACG-5’。Beta-actin:上游3’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-5’,下游3’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-5’。

        1.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞,加入人參皂苷Rg3(0、20、40、60 μmol/L)作用24 h后,加入細(xì)胞裂解液,利用超聲破碎儀進(jìn)行破碎,在12 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min,取上清,每孔20 μg蛋白樣品量上樣。SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白分離,再轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上,5%胎牛血清封閉2 h,caspase-3、Bcl-2、Beta-actin抗體4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌3次后加入熒光二抗孵育2 h。采用UVI凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)量條帶光密度;以Beta-actin為內(nèi)參,以目的蛋白和內(nèi)參蛋白的光密度比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

        1.7 活性氧水平檢測(cè) 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞,加入人參皂苷Rg3(0、20、40、60 μmol/L)作用24 h后,每組收集1×106個(gè)細(xì)胞,洗滌后重懸于PBS中,加入10 mmol/L的DCFH-DA,使細(xì)胞終濃度為1 μmol/L,37 ℃避光溫育20 min,PBS洗滌后重懸,流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

        1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 人參皂苷Rg3對(duì)NCI-H292細(xì)胞增殖影響 與對(duì)照組比較,隨著人參皂苷Rg3濃度增加,細(xì)胞增殖能力下降,且呈濃度依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

        圖1 人參皂苷Rg3對(duì)NCI-H292細(xì)胞增殖影響 圖2 人參皂苷Rg3對(duì)NCI-H292細(xì)胞凋亡影響

        2.2 人參皂苷Rg3對(duì)NCI-H292細(xì)胞凋亡影響 與對(duì)照組比較,隨著人參皂苷Rg3濃度增加,細(xì)胞凋亡能力上升,且呈濃度依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

        2.3 人參皂苷Rg3對(duì)caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)量影響 與對(duì)照組比較,隨著人參皂苷Rg3濃度增加,caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)量上升,且呈濃度依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

        圖3 人參皂苷Rg3對(duì)caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)量影響

        2.4 人參皂苷Rg3對(duì)Keap1 mRNA和Nrf2 mRNA影響 與對(duì)照組比較,隨著人參皂苷Rg3濃度增加,Keap1 mRNA表達(dá)上升,Nrf2 mRNA表達(dá)下降,且呈濃度依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

        圖4 人參皂苷Rg3對(duì)Keap1 mRNA和Nrf2 mRNA影響 圖5 人參皂苷Rg3對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平影響

        2.5 人參皂苷Rg3對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平影響 與對(duì)照組比較,隨著人參皂苷Rg3濃度增加,活性氧水平上升,且呈濃度依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

        3 討論

        根據(jù)我國(guó)癌癥中心統(tǒng)計(jì),2015年,我國(guó)有73.3萬(wàn)例肺癌新發(fā)病例,死亡病例達(dá)到61.0萬(wàn),嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[12]。肺癌患者預(yù)后不良、生存率低與患者多在晚期發(fā)現(xiàn)、腫瘤組織對(duì)化療藥物耐藥等密切相關(guān)[13]。因此,深入探討肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、耐藥機(jī)制對(duì)于肺癌的的診斷、治療及新型靶向藥物的研究具有重要意義。

        人參是我國(guó)傳統(tǒng)中藥成分之一,其主要活性成分為人參皂苷。人參皂苷Rg3具有抑制肺癌細(xì)胞血管生成的作用,主要機(jī)制是通過(guò)降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9等血管新生誘導(dǎo)因子表達(dá)抑制癌細(xì)胞血管生成[14-15]。人參皂苷還可以降低多藥耐藥基因、P糖蛋白的表達(dá),提高其對(duì)化療藥物的敏感性[16-17]。

        細(xì)胞凋亡途徑分為受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑及線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑,Bcl-2和caspase-3是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中的兩種調(diào)節(jié)蛋白。Bcl-2家族的兩種促凋亡蛋白Bax和Bak可使線粒體外膜通透化,導(dǎo)致下游caspase-3以及核酸酶等被活化,隨之維持細(xì)胞生存的蛋白質(zhì)和核酸被降解,細(xì)胞凋亡發(fā)生。Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路是一條機(jī)體抗氧化應(yīng)激及活性氧物質(zhì)的重要通路。Nrf2是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的主要轉(zhuǎn)錄因子,存在于肝、腎、消化道、皮膚、肺[18]。Keap1屬于Kelch家族多區(qū)域阻遏蛋白,位于19p13.2位點(diǎn),是Nrf2的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子[19]。ARE是一個(gè)DNA啟動(dòng)子結(jié)合序列,Nrf2可以激活該啟動(dòng)子序列,當(dāng)ARE序列被激活時(shí),受ARE調(diào)控的相關(guān)基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)靶基因表達(dá),包括代謝、細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡、凋亡及自噬,從而發(fā)揮保護(hù)作用[20]。有研究表明,Nrf2過(guò)表達(dá)和Keap1表達(dá)缺失在非小細(xì)胞肺癌患者中十分常見(jiàn),且與臨床不良預(yù)后、對(duì)順鉑耐藥等密切相關(guān)[21]。癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量活性氧,過(guò)量活性氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核氧化損傷,Nrf2可以減少氧化應(yīng)激,從而減少細(xì)胞凋亡,當(dāng)Keap1表達(dá)缺失時(shí),Nrf2過(guò)表達(dá),導(dǎo)致癌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng),凋亡減少[5]。此外,Nrf2可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-13、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2等生長(zhǎng)因子,因此,當(dāng)Nrf2過(guò)表達(dá)時(shí),還可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[22-23]。某些類(lèi)型肺癌患者存在Keap1突變,導(dǎo)致其蛋白終止密碼子提早出現(xiàn),引起氨基酸種類(lèi)和數(shù)量改變,最終導(dǎo)致Keap1功能缺失,喪失了對(duì)Nrf2的負(fù)性調(diào)控,促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[24]。

        本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):人參皂苷Rg3可抑制NCI-H292增殖,促進(jìn)NCI-H292凋亡,且作用呈濃度依賴(lài)性;人參皂苷Rg3還會(huì)使細(xì)胞內(nèi)抗氧化機(jī)制減弱,出現(xiàn)活性氧蓄積;上述改變可能與Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)。

        綜上所述,人參皂苷Rg3可能通過(guò)抑制Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖,并促進(jìn)其凋亡。

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