鄒喬 李雁 陳一凡 孔煜榮 陳瑜

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由多種肺內(nèi)(如肺炎、誤吸等)或肺外因素引起的，以難治性低氧血癥和進(jìn)行性呼吸窘迫為主要表現(xiàn)的臨床急危重癥。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，中國每年約有67萬ARDS患者，全球范圍內(nèi)ARDS的病死率為30%～40%[1]。目前，臨床僅以保護(hù)性俯臥位機(jī)械通氣作為較高等級(jí)證據(jù)支持的治療措施，仍亟需安全有效的防治手段進(jìn)行干預(yù)[2]。Meta分析研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療ARDS在降低病死率、減少平均機(jī)械通氣時(shí)間、改善氧合指數(shù)、下調(diào)促炎因子等方面優(yōu)勢明顯[3]。

本實(shí)驗(yàn)所采用的益氣化瘀解毒方為全國名老中醫(yī)藥專家、首都國醫(yī)名師杜懷棠教授根據(jù)多年臨床診療經(jīng)驗(yàn)，針對ARDS肺氣虛衰，毒瘀閉肺[4]的關(guān)鍵病機(jī)而創(chuàng)設(shè)的經(jīng)驗(yàn)方。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，益氣化瘀解毒方中劑量組(即本實(shí)驗(yàn)中藥復(fù)方組采用的劑量)可顯著調(diào)節(jié)脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的ARDS模型大鼠炎癥通路蛋白核因子NF-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65/p50、NF-κB抑制因子α(inhibitor of NF-κB，IκBα)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)及炎癥因子白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)水平[5-8]；又運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析[9]，推測本方可能通過上調(diào)小窩蛋白-1(caveolin-1, Cav-1)而干預(yù)ARDS炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，本研究通過觀察益氣化瘀解毒方對ARDS模型大鼠Cav-1蛋白及炎癥因子IL-12、IL-13表達(dá)水平的影響，探討益氣化瘀解毒方調(diào)控ARDS炎癥反應(yīng)的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠18只，6～7周齡，體質(zhì)量(180±10)g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008，于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，每籠6只，普通飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后開始實(shí)驗(yàn)。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審批，編號(hào)：19-54。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

中藥復(fù)方(包括黃芪30 g、黃芩10 g、金銀花15 g、三七10 g、赤芍15 g、炒枳實(shí)12 g、葶藶子15 g、桑白皮15 g，由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供并制成中藥浸膏，批號(hào)：20191030)。

1.3 主要試劑與儀器

大腸桿菌LPS(Sigma，L6511)；Caveolin-1 rabbit polyclonal antibody(Proteintech，16447-1-AP)；大鼠Cav-1 ELISA試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，MB-7123A)大鼠IL-12 ELISA試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，MB-7125B)；大鼠IL-13 ELISA試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，MB-1626B)；BH2光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)；高速離心機(jī)(Thermo)；Varioskan Flash光譜掃描多功能讀數(shù)儀(Thermo Scientific)。

1.4 動(dòng)物分組、給藥與造模

將SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、中藥復(fù)方組3組，每組6只。結(jié)合既往實(shí)驗(yàn)研究確定的最佳造模時(shí)間、劑量與給藥劑量，按12.2 g/(kg·d)(給藥劑量為生藥劑量)用蒸餾水將中藥浸膏配制為中藥溶液，予中藥復(fù)方組大鼠每日灌胃給藥，對照組、模型組大鼠灌服等量蒸餾水，均用60℃溫水浴加熱后灌胃，灌胃量1 mL/(100 g·d)，每日1次，連續(xù)7日。第7日灌胃后6小時(shí)，模型組、中藥復(fù)方組一次性尾靜脈注射LPS溶液(2 mg/kg)，對照組尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液(2 mg/kg)，16小時(shí)后3%戊巴比妥鈉(0.1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。

1.5 標(biāo)本采集與觀測指標(biāo)

1.5.1 肺組織病理 充分暴露大鼠胸腔，摘取全肺，分離右下肺制作病理切片，經(jīng)組織切片、常規(guī)脫蠟、蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色、分色、脫水、封片等步驟，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺泡與肺間質(zhì)形態(tài)、充血水腫及炎癥細(xì)胞浸潤程度等肺組織病理情況。肺組織病理切片及HE染色均在北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心形態(tài)學(xué)檢測平臺(tái)制作完成。

1.5.2 酶聯(lián)免疫法(enzyme lirked immunosorbent assay,ELISA)檢測肺泡灌洗液、肺勻漿Cav-1及血清IL-12、IL-13表達(dá)水平 大鼠開胸結(jié)扎右肺門后，用PBS反復(fù)3次進(jìn)行左支氣管肺泡灌洗，回收肺泡灌洗液，經(jīng)3 000 r/分鐘、4℃離心10分鐘后，取上清液置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?；分離右上肺，剪碎肺組織樣本，加入組織裂解液，冰水混合物中行組織勻漿，經(jīng)12 000 r/分鐘、4℃離心5分鐘后，取上清液置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?；打開腹腔，暴露腹主動(dòng)脈，取腹主動(dòng)脈血3～5 mL于肝素化試管中，經(jīng)3 000 r/分鐘、4℃離心20分鐘后，取血清置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行測定。檢測肺泡灌洗液Cav-1及血清IL-12、IL-13表達(dá)水平時(shí)，將肺泡灌洗液、血清樣本PBS稀釋5倍后測定；檢測肺勻漿Cav-1表達(dá)水平時(shí)，將肺勻漿樣本用PBS稀釋200倍后測定。

1.5.3 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測肺勻漿Cav-1表達(dá)水平 提取肺組織總蛋白，10 000 r/分鐘、4℃離心15分鐘，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠部分80 V、30分鐘，觀察跑到分離膠部分以后，120 V、90分鐘；轉(zhuǎn)膜用80 V、70分鐘；5%的脫脂奶粉室溫封閉1小時(shí)。加入一抗稀釋液，稀釋的一抗抗體(1∶2 000)，孵育、洗滌，再加入相應(yīng)二抗(1∶10 000)，ECL化學(xué)發(fā)光檢測，暗室中顯影。采用成像分析系統(tǒng)Quantity One測量并記錄圖像灰度值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理觀察結(jié)果

對照組大鼠肺組織病理可見肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡腔及間質(zhì)無充血水腫，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肺泡腔及間質(zhì)結(jié)構(gòu)變形，肺泡壁增厚，部分肺泡塌陷，可見炎性滲出；中藥復(fù)方組較模型組大鼠肺組織損傷程度減輕，炎性滲出及出血較少，肺泡結(jié)構(gòu)較完整，塌陷較少。見圖1。

注：×200：A 對照組；B 模型組；C 中藥復(fù)方組；×400：D 對照組；E 模型組；F 中藥復(fù)方組。

2.2 ELISA法檢測大鼠肺泡灌洗液、肺勻漿Cav-1蛋白表達(dá)情況

肺泡灌洗液中，與對照組相比，模型組Cav-1水平顯著減少(P<0.01)；與模型組相比，中藥復(fù)方組Cav-1水平顯著增多(P<0.05)。肺勻漿中，與對照組相比，模型組Cav-1水平顯著減少(P<0.01)；與模型組相比，中藥復(fù)方組Cav-1水平顯著增多(P<0.01)。見表1。

表1 各組ARDS模型大鼠肺泡灌洗液、肺勻漿中Cav-1蛋白表達(dá)水平比較(ELISA法)

2.3 Western Blot法檢測大鼠肺勻漿Cav-1蛋白表達(dá)情況

肺勻漿中，與對照組相比，模型組Cav-1表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，中藥復(fù)方組Cav-1表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。見表2及圖2。

表2 各組ARDS模型大鼠肺勻漿Cav-1蛋白表達(dá)水平比較

圖2 各組ARDS模型大鼠肺勻漿Cav-1蛋白表達(dá)情況

2.4 大鼠血清IL-12、IL-13表達(dá)情況

與對照組相比，模型組IL-12水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，中藥復(fù)方組IL-12水平顯著降低(P<0.01)；與對照組相比，模型組、中藥復(fù)方組IL-13水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠ELISA檢測血清IL-12、IL-13表達(dá)水平比較

3 討論

3.1 Cav-1/IL-12/IL-13在LPS誘導(dǎo)的ARDS發(fā)病中的作用

膿毒癥是ARDS最常見、最嚴(yán)重的病因之一，嚴(yán)重感染者有25%～50%發(fā)生ARDS，病死率高達(dá)70%～90%[10]。其發(fā)病主要由革蘭氏陰性桿菌侵襲所致，LPS為革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分之一，故本實(shí)驗(yàn)采用基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用的LPS尾靜脈注射進(jìn)行造模，模型組大鼠肺組織病理可見ARDS典型特點(diǎn)，表明復(fù)制ARDS模型成功。

Cav-1是一種22 kDa的跨膜支架蛋白，在肺損傷的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1蛋白表達(dá)水平的下調(diào)常伴隨ARDS相關(guān)炎癥因子及NF-κB等炎癥通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的上調(diào)[12-15]。LPS可激活Cav-1[16]，使其與LPS受體Toll樣受體4相互作用，降解IκBα，活化NF-κB，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)一系列炎癥因子轉(zhuǎn)錄及爆發(fā)性表達(dá)，引起肺內(nèi)以巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，破壞肺組織正常結(jié)構(gòu)及功能。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠肺泡灌洗液、肺勻漿中Cav-1蛋白表達(dá)水平均較對照組明顯下調(diào)，說明Cav-1減少在ARDS發(fā)病中具有重要意義。

炎癥因子IL-12、IL-13主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可分別引起肺組織、血漿中促炎因子IL-12及抑炎因子IL-13表達(dá)增加[17-18]。同時(shí)，抑炎因子IL-4、IL-10、IL-13可抑制IL-12、γ干擾素、TNF-α的產(chǎn)生[19]，而IL-12除促進(jìn)炎癥因子γ干擾素表達(dá)形成正反饋外，也可抑制IL-4、IL-13的表達(dá)[20]，因此IL-12/IL-13的表達(dá)常處于一定的平衡。LPS誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)所致的ARDS可能與促炎因子IL-12與抑炎因子IL-13的表達(dá)失衡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中模型組IL-12、IL-13較對照組均升高，與既往研究結(jié)果一致，說明ARDS發(fā)病過程中炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的出現(xiàn)可能與促炎與抑炎因子表達(dá)水平的變化密切相關(guān)。

3.2 益氣化瘀解毒方防治ARDS作用機(jī)理分析

中醫(yī)學(xué)在歷代發(fā)展中積累了豐富的急救醫(yī)療經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)ARDS的臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于“喘脫”“暴喘”等范疇[21]。本病多因患者感受邪毒，壅滯于肺，肺失宣肅，水道不通，飲熱互結(jié)，百脈不暢，瘀血內(nèi)阻，痹肺傷肺而發(fā)病。益氣化瘀解毒方用生黃芪益氣扶正，祛邪防變；金銀花、黃芩清熱解毒，透邪外出；桑白皮、葶藶子、枳實(shí)瀉肺逐飲，降氣平喘；三七、赤芍化瘀通絡(luò)，涼血解毒。全方扶正祛邪兼顧，化瘀解毒而不傷正，益氣扶正而不礙邪。

本實(shí)驗(yàn)中藥復(fù)方組大鼠肺組織病理可見肺損傷程度明顯減輕，表明中藥復(fù)方對ARDS可起到良好的防治效果。中藥復(fù)方組Cav-1蛋白表達(dá)水平較模型組顯著上調(diào)，促炎因子IL-12表達(dá)水平較模型組明顯減少；中藥復(fù)方組與模型組抑炎因子IL-13表達(dá)水平均較對照組升高，說明益氣化瘀解毒方能上調(diào)Cav-1水平，增加抑炎因子表達(dá)，減少促炎因子表達(dá)，起到減輕炎癥反應(yīng)、降低肺損傷的作用。關(guān)于中藥復(fù)方是否通過Cav-1蛋白對ARDS炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)起到關(guān)鍵調(diào)控作用的直接證據(jù)仍有待在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步闡明。