李矜 張晨 辛競妍 吳長江 朱雨菲 張濤靜

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者中常見的慢性并發(fā)癥之一，該病在糖尿病患者中的發(fā)病率超過60%[1]，目前有研究表明，DPN的發(fā)病與氧化應激及炎癥反應等有關。DPN目前的西醫(yī)治療多采用控制血糖聯(lián)合營養(yǎng)神經及減輕炎癥反應等方法。有研究表明，單用西醫(yī)治療療效劣于中西醫(yī)同治，尤其中藥復方制劑能作用于DPN發(fā)病機制的多個靶點[2]，成為近期研究熱點。在對糖尿病周圍神經病變的臨床治療及實驗研究中，中藥復方糖絡寧制劑的療效已經得到初步證實[3-6]，本課題組前期研究表明，糖絡寧制劑能通過調控微小RNA表達有效改善高糖環(huán)境中大鼠背根神經節(jié)神經元細胞(dorsol root ganglion neurons,DRGn)細胞的氧化應激及細胞凋亡。本實驗則是在體外研究的基礎上探索糖絡寧含藥血清對高糖環(huán)境下miR-146a的調控及其對高糖誘導下的大鼠背根神經節(jié)細胞炎癥反應的影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級6～8周齡雄性SD大鼠20只及臨產期雌性SD大鼠若干只，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。本實驗期間飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物實驗中心，飼養(yǎng)標準：大鼠SPF級屏障環(huán)境，中心溫度(20±2)℃，濕度45%～65%，12小時明暗交替照明。本實驗流程由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院倫理委員會論證通過。

1.2 實驗藥物

糖絡寧復方制劑(主要成分為生黃芪20 g、山茱萸9 g、川續(xù)斷12 g、狗脊15 g、丹參15 g、全蝎6 g、木瓜10 g)，生藥濃度為0.5 g/mL，本制劑制于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院制劑室。

1.3 主要試劑

miR-146a激動劑(miR-146a mimics)由廣州銳博生物公司合成；CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒(011521210435)購自碧云天; DMEM(dulbecco’s modified eagle medium )(C11995500BT)、Neurobasal(神經基礎)培養(yǎng)基(21103049)購自Gibco; SuperScript III RT 逆轉錄試劑盒 (ABI-invitrogen ，批號：WC3125084); Sybr qpcr mix (ABI-invitrogen，批號：WC1315116); BeyoRTTMII cDNA 第一鏈合成試劑盒 (碧云天，批號：011521211537)。

1.4 正常血清及含藥血清的制備

20只大鼠隨機均分為2組，每組10只，分為含藥血清組及正常血清組，根據以往實驗得出的最佳用藥濃度分別以糖絡寧生藥濃度按5 g/(kg·d)及蒸餾水等體積灌胃，連續(xù)給藥10天。每天早晚灌胃，期間保持其余飼養(yǎng)條件相同及穩(wěn)定。最后一次灌胃后的兩小時內腹腔注射 2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉大鼠，麻醉成功后去除腹毛，酒精消毒，用無菌眼科剪暴露腹主動脈，用一次性采血針及真空采血管分別收集兩組大鼠腹主動脈血液，在37℃的環(huán)境中靜置2小時，3500 rpm離心，取上層血清于60攝氏度水浴滅活30分鐘，過濾器過濾除菌，除菌后的含藥血清放置于-80℃的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 大鼠背根神經節(jié)細胞的分離及分組培養(yǎng)

參考本實驗組以往的動物研究[7-9]進行DRGn細胞的分離，將24小時內的新生大鼠于75%的乙醇中消毒后置于培養(yǎng)皿中，無菌眼科剪剪開大鼠背部皮膚并將椎管沿縱向剪開，暴露脊髓后分離其兩側的DRG組織并去除包膜，用預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)溶液沖洗DRG組織2次后將DRG組織剪碎，用0.25%的胰蛋白酶完全消化并用尖頭吸管吹打形成單細胞懸液。12000 rpm條件下離心5分鐘，待細胞沉淀后加入DMEM完全培養(yǎng)基，重懸細胞，并將細胞接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)6小時后棄去DMEM完全培養(yǎng)基，PBS溶液清洗后將細胞置于神經元專用培養(yǎng)基中，并加入阿糖胞苷純化，按3.5日一次的頻率換液，直至70%～80%的細胞貼壁后按照實驗需求進行分組。本實驗以既往研究結果設定150 mmol/L為高糖濃度，并將細胞分為正常組、高糖組、糖絡寧組及miR-146a基因過表達組，其中正常組(空白血清培養(yǎng))、高糖組(150 mmol/L葡萄糖+空白血清培養(yǎng))、糖絡寧組(150 mmol/L葡萄糖+糖絡寧含藥血清培養(yǎng))、miR-146a基因過表達組(150 mmol/L葡萄糖+miR-146a激動劑)，48小時后，收集各組細胞并進行相關檢測。

1.6 CCK-8 方法檢測各組細胞活力。

將DRGn細胞接種至96孔板中，同時設置5個復孔，按上述分組培養(yǎng)24小時后加入10微升CCK-8溶液，于37℃烘箱避光孵育1小時，酶標儀比色，檢測波長為450納米處的光密度(optical density，OD)值并計算細胞活力(實驗組OD值/正常組OD值×100%)，同樣方法依次檢測培養(yǎng)48小時及72小時的細胞活力值。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測各組細胞上清液中炎癥因子的表達情況

將各組細胞收集，離心(3000 rpm，10分鐘)，吸取上清液備用，按照ELISA試劑盒操作步驟依次檢驗炎癥因子[白介素-6、白介素-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF)-α]的表達情況。每組實驗獨立重復3次。

1.8 實時熒光定量 PCR檢測各組細胞miR-146a和各炎癥因子的表達水平

取各組神經元細胞，并提取各組背根神經元總核糖核酸。紫外分光光度計分別檢測RNA的濃度及純度。按操作說明反轉錄合成cDNA，依次加入操作說明提示的試劑，42℃孵育50分鐘，85℃孵育5分鐘，得到的cDNA -20℃環(huán)境下保存。再以合成的cDNA進行擴增，反應結束后記錄CT值，運用2-ΔΔCt公式計算相對數(shù)值，實驗獨立重復三次，計算平均值。引物序列見下表1。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 糖絡寧含藥血清對細胞活力的影響

各組細胞OD值隨作用時間的延長而逐漸下降。在相同時間點，與正常組相比，高糖組、糖絡寧組及miR-146a基因過表達組OD值均明顯下降(P<0.05)。與高糖組相比，糖絡寧組與miR-146a基因過表達組細胞OD值均明顯升高(P<0.05)。說明DRGn細胞在高糖環(huán)境下活力下降，而經糖絡寧及miR-146a激動劑干預后，細胞活力可明顯上升。見表1。

表1 不同時間點各組細胞OD值的比較

2.2 糖絡寧含藥血清對細胞上清液中炎癥因子蛋白表達的影響

與正常組相比，高糖組、糖絡寧組及miR-146a基因過表達組的炎癥因子蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)。與高糖組相比，糖絡寧組與miR-146a基因過表達組的炎癥因子蛋白表達水平均明顯下降(P<0.05)。說明高糖條件下，炎癥因子蛋白表達水平上調，而糖絡寧及miR-146a激動劑可明顯抑制炎癥因子的蛋白表達。見表2。

表2 各組細胞上清液中炎癥因子的蛋白相對表達水平比較

表3 各組細胞炎癥因子的基因相對表達水平比較

2.3 糖絡寧含藥血清對細胞炎癥因子基因表達的影響

與正常組相比，高糖組、糖絡寧組及miR-146a基因過表達組的炎癥因子基因表達水平均明顯升高(P<0.05)。與高糖組相比，糖絡寧組與miR-146a基因過表達組的炎癥因子基因表達水平均明顯下降(P<0.05)。說明高糖條件下，炎癥因子基因表達水平上調，而糖絡寧及miR-146a激動劑可明顯抑制炎癥因子的基因表達水平。

2.4 糖絡寧含藥血清對細胞miR-146a基因表達的影響

與正常組相比，高糖組、糖絡寧組的miR-146a基因表達水平均明顯下降(P<0.05)，miR-146a基因過表達組miR-146a基因表達水平明顯升高(P<0.05)，與高糖組相比，糖絡寧組與miR-146a基因過表達組的miR-146a基因表達水平均明顯升高(P<0.05)，與糖絡寧組相比，miR-146a基因過表達組的miR-146a基因表達水平均明顯升高(P<0.05)。說明DRGn細胞在高糖條件下，miR-146a基因表達水平下調，而糖絡寧可明顯上調miR-146a的基因表達水平。

表4 各組細胞中miR-146a基因的相對表達水平比較

3 討論

DPN在中醫(yī)學中尚未有明確的病名，結合目前的臨床及實驗研究，現(xiàn)代各醫(yī)家對DPN的病因病機等有著不同的見解，多認為該病可屬于中醫(yī)“消渴痹病”“脈痹”“痿證”等范疇[10]，其辨證為氣血不足、經脈受阻、氣滯血瘀。糖絡寧則是針對其氣血不足、肝腎虧虛、脈絡瘀阻所研制[11]，目前研究發(fā)現(xiàn)糖尿病周圍神經病變的發(fā)生發(fā)展是多種因素共同作用的結果，其作用機制十分復雜，主要與炎癥作用、糖代謝產物的過度堆積、多元醇通路的激活、氧化應激、神經營養(yǎng)因子缺乏及RNA的非編碼調節(jié)作用等多種因素有關[12]。miR-146是最先發(fā)現(xiàn)在免疫應答中發(fā)揮正反饋調節(jié)作用的miRNA，包含miR-146a和miR-146b兩個成員[13]。炎癥反應是當機體感受到內、外界某些有害刺激時產生的一種防御性反應[14]。其中TNF-α是一種炎癥前因子，不僅可引起組織炎性損傷，還可刺激白介素-6等促炎因子形成，白介素-6作為促炎作用最強的細胞因子與腫瘤壞死因子-α共同起到促炎作用[15]。由于DPN的發(fā)生發(fā)展始終伴隨著炎癥反應，周圍神經受損后，軸突出現(xiàn)變性，白介素-6、白介素-1β、TNF-α等細胞因子表達上調，啟動炎性級聯(lián)反應，激活核轉錄因子，誘導細胞凋亡[16]。

目前有研究表明，中藥提取物或中藥復方制均可有效減輕糖尿病周圍神經病變的炎癥反應，如穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥漳芤种芇DPN大鼠血清中白介素-6、VCAM-1的表達，有效緩解PDPN大鼠體內的炎癥反應[17]。中藥復方制劑加味黃芪桂枝五物湯對DPN的治療機制可能是通過上調miR-146a，進而抑制白介素-1β、TNF-α激活，從而減少炎癥因子的表達，減輕炎癥反應[18]。本課題組前期針對糖絡寧對DPN的治療機制做出的研究表明糖絡寧復方制劑能有效通過調控miR-200a、miR-211及其相關通路影響氧化應激及細胞凋亡，本實驗同時證明糖絡寧可通過調控miR-146a減輕炎癥反應，證明糖絡寧可作用于多靶點實現(xiàn)對DPN的治療，但本實驗目前僅建立在體外細胞實驗的基礎上，還需在日后完善該藥物在體內的研究。

綜上所述，糖絡寧可明顯上調miR-146a的基因表達水平，同時抑制白介素-6、白介素-1β、TNF-α的表達，由此可以推測糖絡寧能夠減輕高糖誘導的背根神經節(jié)細胞炎癥反應，其部分機制可能是通過上調miR-146a的表達水平實現(xiàn)的。