彭高強(qiáng) 文穎娟 陳茉 仝武寧

重癥肌無力(myasthenia gravis, MG)是一種影響骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫性疾病，其特征為波動性肌無力，常累及眼肌、咽喉及四肢，具有晨輕暮重，活動后加重，休息時(shí)減輕，可發(fā)生于全身各個(gè)骨骼肌的特點(diǎn)[1]。目前治療MG沒有特效藥，一般采取對癥治療，如膽堿酯酶抑制劑、免疫抑制治療等。

中醫(yī)無重癥肌無力這一說法，但根據(jù)其主要表現(xiàn)為肢肉活動無力而將其納入“痿癥”范疇。主要是由于脾虛或痰濕瘀血等濁邪阻滯中焦，導(dǎo)致脾不能輸布散津至四肢肌肉而表現(xiàn)出四肢肌肉收縮無力或偏廢不用的臨床癥狀，以脾虛為本，濁邪阻滯為標(biāo)，病機(jī)總屬于虛實(shí)夾雜[2-3]。動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp1)是調(diào)控線粒體分裂的一種蛋白，對線粒體分裂起主要作用，線粒體分裂增加會使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，線粒體片段化增多、細(xì)胞內(nèi)Ca2+紊亂以及活性氧的大量產(chǎn)生從而導(dǎo)致線粒體的損傷[4-5]，研究表明，抑制大鼠骨骼肌中線粒體Drp1蛋白表達(dá)，可以減少線粒體的過度分裂，從而對線粒體功能的改善，骨骼肌收縮能力有一定的積極作用[6]，前期實(shí)驗(yàn)研究表明葛根及其復(fù)方能夠改善重癥肌無力大鼠骨骼肌肌力及線粒體功能[3, 7]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)觀察葛根及其復(fù)方對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力大鼠骨骼肌組織及線粒體Drp1蛋白影響，以進(jìn)一步明確葛根治療MG的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

80只SPF級Lewis大鼠，雌性，體質(zhì)量為(160～180)g，精神狀況良好，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(川)2020-030。本實(shí)驗(yàn)通過陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查，動物倫理編號：SUCM-DL20210621001。

1.2 實(shí)驗(yàn)處方與藥物

葛根方：葛根20 g；葛芪方：黃芪15 g、葛根20 g；葛參方： 丹參15 g 、葛根20 g；葛妙方：牛膝15 g、黃柏15 g、薏苡仁15 g、蒼術(shù)15 g、葛根20 g；葛芪參妙方：牛膝15 g、黃柏15 g、薏苡仁15 g、黃芪15 g、蒼術(shù)15 g、葛根20 g。中藥飲片由陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院提供。陽性對照組藥物：強(qiáng)的松龍(由天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司提供)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

鼠源性AchR-α亞基97-116肽段序列(貨號：C8385FE270-1，金斯瑞生物科技股份有限公司)、2.5%磷酸鹽緩沖液(PBS，貨號：ZLI-9062，賽默飛世爾科技公司)、完全福氏劑(貨號：F5881)、不完全福氏劑(貨號：F5506，美國sigma公司)。一抗、二抗稀釋液(貨號：WB0158、WB0159)、蛋白定量試劑盒(貨號：WB2123)等均來自上海威奧公司。組織勻漿器、脫色搖床、全波長酶波儀等均由陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 分組造模

大鼠購買后于陜西中醫(yī)藥大學(xué)動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后隨機(jī)將大鼠分為空白組、模型組、葛芪組、葛參組、葛妙組、葛根組、葛芪參妙組、強(qiáng)的松組，共8組，每組各10只。進(jìn)行造模，將肽段、PBS、完全福氏劑三者按照1∶1.5∶1.5的比例混合制成乳劑；取除空白組以外的大鼠，分別在其后足底、腹部、背部淺表組織注射入200 μL(含肽段100 μg)乳劑進(jìn)行造模，用相同劑量的PBS注射空白組。30天后進(jìn)行第二次免疫，將肽段、PBS、不完全福氏劑三者按照1∶3∶3的比例混合成免疫乳劑，再次皮下注射200 μL(含肽段50 μg)乳劑以強(qiáng)化免疫造模大鼠，空白組注射同量的PBS。

1.5 給藥方法

造模成功后，給予模型組、空白組生理鹽水灌胃，3 mL/次。葛根復(fù)方組與強(qiáng)的松組按照人鼠劑量公式換算，葛根組為2.08 g/(kg·d)，葛芪組3.65 g/(kg·d),葛參組3.65 g/(kg·d),葛妙組8.33 g/(kg·d)，葛芪參妙組11.46 g/(kg·d) ，強(qiáng)的松組給予5.4 mg/(kg·d)。每日灌胃1次，連續(xù)28天。

1.6 取材及檢測

1.6.1 蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)對骨骼肌組織的觀察 給藥28天后，禁食12小時(shí)，隨機(jī)從每組大鼠選取5只并給予大鼠腹腔麻醉，將大鼠處死，沿著坐骨神經(jīng)走向分離出骨骼肌并將其切成小塊，然后使用固定液對組織進(jìn)行固定，再經(jīng)石蠟包埋將包埋好的骨骼肌組織進(jìn)行病理切片(切片厚度為3 μm～4 μm)、脫水、染色、封片等步驟，再通過顯微鏡下觀察組織的變化。

1.6.2 透射電鏡觀察大鼠骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)變化 將大鼠骨骼肌組織分成小塊，經(jīng)PBS、四氧化鋨固定、梯度乙醇脫水、組織包埋后，于透射電鏡觀察下觀察線粒的超微結(jié)構(gòu)。

1.6.3 蛋白印跡法檢測大鼠各組骨骼肌Drp1蛋白的表達(dá) 取大鼠各組骨骼肌組織剪切成細(xì)小的碎片，然后按每20 mg組織加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，經(jīng)離心、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育后對Drp1蛋白進(jìn)行顯影拍照并分析條帶的灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨骼肌病理組織變化

由圖看出，空白組大鼠骨骼肌組織完整、無斷裂、無腫脹、細(xì)胞核排列整齊。較空白組而言模型組骨骼肌肌纖維排列紊亂有斷裂現(xiàn)象、細(xì)胞核排列不規(guī)則并有炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組相比，藥物治療各組骨骼肌肌纖維紊亂斷裂以及緊密度現(xiàn)象都有一定程度改善，細(xì)胞核偏移、炎癥浸潤逐漸減少，其中以葛芪參妙組效果最優(yōu)，見圖1。

2.2 電鏡下各組大鼠骨骼肌線粒體變化情況

由圖看出，空白組大鼠骨骼肌線粒體排列整齊，呈長橢圓形，線粒體與肌節(jié)平行，線粒體結(jié)構(gòu)清晰可見。模型組大鼠骨骼肌線粒體出現(xiàn)腫脹變形，線粒體嵴斷裂、模糊不清甚至形成空泡。葛根組大鼠骨骼肌線粒體排列較整齊，部分線粒體有腫脹、變形、線粒體嵴紊亂及外膜破裂現(xiàn)象。葛芪組骨骼肌肌節(jié)較清晰，線粒體部分發(fā)生了腫脹、基質(zhì)減少、外膜破壞及小范圍空泡的形成。葛參組肌纖維間隙增大、部分線粒體也出現(xiàn)了溶脹變大。葛妙組能夠觀察到線粒體形態(tài)被拉長、腫脹、溶解。葛芪參妙組線粒體總體排列整齊、線粒體膜結(jié)構(gòu)完整、結(jié)構(gòu)清晰，只有少量線粒體出現(xiàn)了腫脹。強(qiáng)的松組能夠觀察到骨骼肌肌纖維之間有明顯的間隙，肌節(jié)排列相對不平行，較多的線粒體出現(xiàn)了溶解、腫脹、嵴紊亂、基質(zhì)減少?？偠灾?，和模型組相比，治療各組肌纖維緊密度、肌節(jié)平行度有所改善、線粒體腫脹程度、空泡化、嵴紊亂情況都有不同程度緩解，其中以葛芪參妙組恢復(fù)效果最優(yōu)，見圖2。

注：A 空白組； B 模型組；C 葛根組；D 葛芪組；E 葛參組；F 葛妙組；G 葛芪參妙組；H 強(qiáng)的松組。

注：A 空白組； B 模型組；C 葛根組；D 葛芪組；E 葛參組；F 葛妙組；G 葛芪參妙組；H 強(qiáng)的松組。

2.3 各組小鼠骨骼肌線粒體Drp1蛋白的比較

圖3、表1結(jié)果顯示：空白組Drp1蛋白明顯低于其余各組骨骼肌中Drp1蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)；與模型組相比，藥物干預(yù)組中Drp1蛋白有不同程度降低(P<0.05)，其中以葛妙、葛芪參妙組中Drp1蛋白表達(dá)降低幅度最大(P<0.01)，優(yōu)于強(qiáng)的松組(P<0.01)，葛根組、葛芪組與強(qiáng)的松組組間無明顯差異(P>0.05)。表明了葛根復(fù)方能夠調(diào)節(jié)大鼠骨骼肌組織中線粒體Drp1蛋白表達(dá)。

表1 各組大鼠骨骼肌Drp1蛋白表達(dá)比較

圖3 各組大鼠線粒體Drp1蛋白表達(dá)情況

3 討論

中醫(yī)根據(jù)MG主要以四肢筋脈松弛無力，不能隨意運(yùn)動或伴有肌肉萎縮的臨床表現(xiàn)將其納入“痿癥”范疇。中醫(yī)認(rèn)為，脾主運(yùn)化，為氣血生化之源，脾健則氣血等精微物質(zhì)才能充養(yǎng)臟腑經(jīng)絡(luò)、四肢百骸才能發(fā)揮正常的生理活動；脾虛會導(dǎo)致痰濕、瘀血不化，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉組織得不到精微物質(zhì)濡養(yǎng)而出現(xiàn)肢體不用的情況，故普遍認(rèn)為脾虛兼痰瘀濁邪內(nèi)阻是MG發(fā)病的主要原因，其病機(jī)多為虛實(shí)夾雜[2-3]?！端煞逭f疫》云：“脾主肌肉，外應(yīng)四肢，肌肉痿，行善瘈，腳下痛。脾太過則令四肢不舉?！庇纱藶镸G從脾治療提供了理論依據(jù)。雷孝文[8]觀察到通過益氣健脾法能夠有效改善重癥肌無力大鼠骨骼肌線粒體能量代謝，從而起到治療MG的作用。由此證明，脾虛引起骨骼和線粒體異常是MG發(fā)病重要原因。因此，本研究選取葛根為主藥藥物進(jìn)行研究(葛根甘、辛，歸于脾胃經(jīng)，具有祛邪和扶正作用，與MG發(fā)病機(jī)制相對應(yīng)[9])，考慮到脾的功能減退不但容易使肌肉組織失去濡養(yǎng)還容易因運(yùn)化無力導(dǎo)致氣血阻滯，痰瘀等病理產(chǎn)物堆積形成，進(jìn)而導(dǎo)致MG在疾病的發(fā)展過程中形成“因虛致實(shí)、虛實(shí)夾雜”的局面。以往對MG的實(shí)驗(yàn)多從補(bǔ)虛入手，少有從補(bǔ)虛瀉實(shí)法治療MG的實(shí)驗(yàn)，故本實(shí)驗(yàn)分別佐以健脾的黃芪、活血的丹參、清熱祛濕的四妙散，以觀察葛根復(fù)方對MG大鼠骨骼肌及線粒體的影響。由于Drp1蛋白在骨骼肌過度表達(dá)會使骨骼肌中線粒體能量代謝紊亂，導(dǎo)致肌肉質(zhì)量、運(yùn)動能力降低[10]。由此可以看出Drp1蛋白高表達(dá)可能跟肌肉受損存在著重要聯(lián)系。為此本實(shí)驗(yàn)也對Drp1蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測，本研究發(fā)現(xiàn)模型組骨骼肌組織及線粒體結(jié)構(gòu)損傷、Drp1蛋白表達(dá)明顯高于空白組。總而言之，Drp1蛋白表達(dá)結(jié)果與病理組織及電鏡結(jié)果總體一致，但值得指出的是葛妙組中骨骼肌病理組織及線粒體結(jié)構(gòu)恢復(fù)不及葛芪參妙組，而在蛋白印跡法檢測Drp1蛋白顯示二者并無明顯差異。出現(xiàn)這原因筆者分析可能有兩點(diǎn)：一是分裂蛋白Drp1表達(dá)開始下降，線粒體結(jié)構(gòu)還尚未恢復(fù)；二是蛋白表達(dá)測量時(shí)可能存在一定的誤差。結(jié)合電鏡結(jié)果可以看出重癥肌無力會促使骨骼肌線粒體分裂從而引起線粒體質(zhì)量受損，經(jīng)葛根復(fù)方治療后線粒體結(jié)構(gòu)有所好轉(zhuǎn)，Drp1蛋白表達(dá)量也逐漸下降并向空白組靠近，其中以葛芪參妙組最明顯，由此說明葛根復(fù)方可抑制Drp1蛋白表達(dá)、降低線粒體的分裂程度，促進(jìn)線粒體質(zhì)量的恢復(fù)。從中醫(yī)角度分析，葛根雖有扶正祛邪的功效，但藥物單一，故療效一般。而葛芪參妙組由葛根、黃芪、丹參、四妙散組成的復(fù)方，具有益氣活血、通絡(luò)祛濕作用，增強(qiáng)了葛根扶正祛邪的功效，更符合MG“虛實(shí)夾雜”的病因病機(jī)，所以療效更顯著。

綜上，本實(shí)驗(yàn)揭示了葛根復(fù)方在重癥肌無力大鼠模型性中具有降低Drp1蛋白表達(dá)、減少線粒體的分裂、促進(jìn)線粒體恢復(fù)和改善骨骼肌組織的功效。由于線粒體融合蛋白、分裂蛋白是維持線粒體功能的重要蛋白，本實(shí)驗(yàn)只對線粒體分裂蛋白進(jìn)行檢測，未對融合蛋白檢測，故存在一定的不足，因此在以后的實(shí)驗(yàn)將對融合蛋白進(jìn)行研究。