崔靜文 胡慧

突發(fā)性耳聾也稱急性特發(fā)性感音神經(jīng)性聽力損失或特發(fā)性突聾，72小時(shí)內(nèi)突然發(fā)生的、原因不明的感音神經(jīng)性聽力損失，至少在相鄰的兩個(gè)頻率聽力下降≥20 dBHL。該病是耳鼻喉科常見病和疑難病之一，其病因病機(jī)錯(cuò)綜復(fù)雜，研究認(rèn)為突發(fā)性耳聾的主要病因?qū)W說有病毒感染、藥物影響、應(yīng)激反應(yīng)和免疫因素等學(xué)說[1]。耳蝸血管因其特殊的解剖結(jié)構(gòu)，當(dāng)受到各種原因影響出現(xiàn)微循環(huán)障礙時(shí)，局部就會(huì)蓄積大量自由基，當(dāng)其超過耳蝸中抗氧化酶的清除作用時(shí)，即可造成毛細(xì)胞的損傷改變或壞死，造成聽力下降[2]。慶大霉素的耳毒性造成傷害的途徑主要來自于活性氧的生成，活性氧在內(nèi)耳造成一系列反應(yīng)，被認(rèn)為是最早的事件，最終引起毛細(xì)胞的凋亡[3]。本研究以慶大霉素耳毒性造成豚鼠聽力損傷模型，旨在探究艾灸對于慶大霉素耳毒性造成的豚鼠模型是否具有清除氧自由基，改善微循環(huán)，抑制細(xì)胞凋亡的功能，以探究其在治療突發(fā)性耳聾中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用耳廓反射靈敏的白色紅目健康豚鼠18只，雄性，體質(zhì)量250～350 g，耳廓聲音反射靈敏，無噪音暴露史及藥物使用史。豚鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動(dòng)物房，標(biāo)準(zhǔn)飼料養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，室溫22～26℃，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。豚鼠購自北京為通利華公司，動(dòng)物批號(hào)：No.110011201110102486。經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理審查許可。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要儀器 腦干誘發(fā)電位儀(首都醫(yī)科大學(xué)耳鼻喉科研實(shí)驗(yàn)室提供)，顯微手術(shù)器械，解剖顯微鏡，超凈工作臺(tái)，-80℃低溫冰箱，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(THERMO)。

1.2.2 主要試劑 硫酸慶大霉素粉劑，戊巴比妥鈉，蒸餾水，9%氯化鈉注射液，10%中性福爾馬林固定液，0.5%伊紅乙醇染色液，中性樹膠，95%乙醇，無水乙醇等。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)耗材 自制豚鼠固定袋，1 mL一次性注射器，5 mL 一次性注射器，棉簽，5 mL、10 mL、50 mL EP 管，燒杯50 mL，鑷子，止血鉗，剪刀，移液管，移液槍，組織剪，安瓿瓶，液氮，記號(hào)筆，豚鼠鼠料，豚鼠墊料等。

1.3 動(dòng)物分組、造模與干預(yù)方法

18只豚鼠適應(yīng)性分籠飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為3組，即慶大霉素組、慶大霉素+艾灸組和生理鹽水組。干預(yù)方法見表1，具體如下：慶大霉素組腹腔注射硫酸慶大霉素120 mg/(kg·d)，連續(xù)14天；慶大霉素+艾灸組肌注硫酸慶大霉素120 mg/(kg·d)，注射后立即予艾灸治療15分鐘1次/天，將豚鼠固定后暴露雙耳外耳道，采用“百笑灸”固定于外耳道口，艾灸燃燒期間距離外耳道口約2～4 cm，艾灸15分鐘，連續(xù)14天；生理鹽水組腹腔注射9%的生理鹽水2.4 mL/(kg·d)，連續(xù)14天。整個(gè)過程中避免接觸噪聲，每兩天測量豚鼠體重以調(diào)整藥量并嚴(yán)密觀察豚鼠的毛發(fā)、食量、排泄物和活動(dòng)度等變化。

表1 各組豚鼠干預(yù)方法

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 Click聽性腦干反應(yīng)檢測 所有干預(yù)結(jié)束后一天，進(jìn)行Click聽性腦干反應(yīng)檢測。采用2%戊巴比妥鈉麻醉劑，腹腔注射式麻醉，麻醉前稱量各組豚鼠體重，按照3 mg/100 g進(jìn)行麻醉，麻醉時(shí)豚鼠頭低腳高位抓取，腹部朝上，于豚鼠腹部腹白線兩側(cè)呈30度進(jìn)針，刺入腹肌，進(jìn)入腹膜腔，有落空感時(shí)，需進(jìn)行針管回抽，確定未刺入腹腔臟器血管后，注射麻醉劑。將已進(jìn)入深度麻醉后的豚鼠移入電磁屏蔽箱內(nèi)，對豚鼠進(jìn)行ABR閾值檢測在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行測試，記錄電極插入顱頂正中皮下，參考與接地電極分別插人同側(cè)與對側(cè)耳后，耳機(jī)插入耳外耳道口約0.5 cm，刺激聲為交替短聲(click)，重復(fù)率16次/秒，平均疊加500次，測試從90 dB強(qiáng)度依次以10 dB向下減弱，觀測Ⅲ波的引出最小刺激強(qiáng)度為閾(因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中Ⅲ波最明顯)，記錄各組豚鼠ABR閾值。測聽室內(nèi)保持黑暗并緊關(guān)隔聲門以減少外界干擾。

1.4.2 血清一氧化氮(nitric oxide, NO)、內(nèi)皮素(endothelin, ET)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol, CHDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL-C)檢測 三組共18只豚鼠，ABR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血處死豚鼠，將全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)，然后1000 g離心20分鐘，取上清，使用前將血清緩慢均衡至室溫(18～25°C)，血清標(biāo)本推薦稀釋大約50倍，取10 μL血清加入490 μL PBS。標(biāo)本使用0.01 mol/L的PBS稀釋(PH=7.0～7.2)。 應(yīng)用相關(guān)試劑盒(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供) 分別測定豚鼠血清中NO、ET、TG、CHDL、LDL-C的含量，操作規(guī)程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4.3 耳蝸氧化指標(biāo)SOD/MDA檢測 三組共18只豚鼠，在腹主動(dòng)脈取血后，斷頭，暴露出右側(cè)聽泡迅速打開，在解剖顯微鏡下剝離耳蝸，并將耳蝸迅速放入液氮中進(jìn)行冷凍，冷凍30分鐘左右，隨后取出耳蝸以研缽將其研磨至碎片，取適量待測研磨好的耳蝸碎片，加入生理鹽水，用分散機(jī)將耳蝸組織進(jìn)行勻漿2分鐘，將勻漿移入10 mL EP管中，4000 rpm離心15分鐘后用移液槍提取上清液，保存在-80℃冰箱以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。整個(gè)操作過程要保持耳蝸組織在冰水混合物中以保證后續(xù)檢測指標(biāo)活性。 應(yīng)用相關(guān)試劑盒 (試劑盒由南京建成生物工程研究所提供) 分別測定耳蝸組織中超氧化物歧化酶(supper oxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondial dehyde, MDA)的含量，操作規(guī)程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4.4 Pcr計(jì)量耳蝸BAX、BCL2轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平 三組共18只豚鼠，取適量待測研磨好的右側(cè)耳蝸碎片，按說明書記載提取樣品總RNA，進(jìn)行總RNA質(zhì)量檢測，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量檢測。

1.4.5 耳蝸螺旋韌帶血管紋鋪片 三組豚鼠各取2只左側(cè)耳蝸用于耳蝸血管紋鋪片，主要方法是將琥珀酸鈉(0.2 mol/L)、磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(0.1%)配置成琥珀酸脫氫酶染色液，待用。斷頭后，將豚鼠蝸尖鉆孔并摘除鐙骨，打開園窗，將琥珀酸脫氫酶染色液灌入耳蝸，在37℃恒溫箱內(nèi)作用40～60分鐘，再將耳蝸浸入10%中性福爾馬林固定液，固定時(shí)間為24小時(shí)，常規(guī)脫鈣，分離取出全耳蝸基底膜，移入載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片，中性樹膠封固。用微細(xì)分離針取耳蝸第三轉(zhuǎn)外側(cè)壁螺旋韌帶，移入載玻片樹脂滴中，鋪片，螺旋韌帶一面朝上，封片，觀察并拍照。

1.4.6 免疫熒光染色方法 檢測耳蝸血管紋附近血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá) 三組豚鼠各取4只左側(cè)耳蝸用于檢測VEGF表達(dá)，將耳蝸剝離血管紋，鋪片，脫蠟、水化、PBS洗5分鐘3次，而后以3.3%過氧化氫分化10分鐘，再次PBS洗5分鐘3次，滴加10%牛血清阻斷非特異性抗體20分鐘，滴加VEGF多克隆抗體(1∶100)37℃1小時(shí)，PBS洗5分鐘三次，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗(1∶50)37℃ 1小時(shí)。PBS洗5分鐘三次。熒光染色物鏡讀片，拍照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)后各組豚鼠clickABR閾值比較

與空白組比較，慶大霉素組與慶大霉素+艾灸組豚鼠的平均聽閾值明顯升高(P<0.05)。與慶大霉素組比較，慶大霉素+艾灸組聽力閾值明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組豚鼠平均聽閾值

2.2 耳蝸螺旋韌帶血管紋觀察

空白組螺旋韌帶血管紋顯示基本正常，粗細(xì)均勻順暢；慶大霉素組可見耳蝸螺旋韌帶血管紋屈曲變窄，血管粗細(xì)不均；慶大霉素+艾灸組可見耳蝸螺旋韌帶血管紋結(jié)構(gòu)稍有不流暢，粗細(xì)稍顯不均。見圖1。

2.3 豚鼠耳蝸組織中MDA與SOD含量

結(jié)果顯示，與空白組相比，慶大霉素組與慶大霉素+艾灸組耳蝸組織MDA含量上升，SOD含量下降，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與慶大霉素組相比，慶大霉素+艾灸組MDA含量下降，SOD含量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表3。

注:A 空白組;B 慶大霉素組;C 慶大霉素+艾灸組

表3 各組豚鼠耳蝸組織SOD、MDA含量

2.4 豚鼠血清ET與NO水平

與空白組比較，慶大霉素組與慶大霉素+艾灸組血清ET含量升高，血清NO含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與慶大霉素組比較，慶大霉素+艾灸組血清ET含量降低，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，血清NO含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組豚鼠血清NO、ET含量

2.5 耳蝸Bcl-2/Bax蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平

與空白組比較，慶大霉素組與慶大霉素+艾灸組耳蝸Bcl-2含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Bax含量慶大霉素組升高，慶大霉素+艾灸組降低，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Bcl-2/Bax值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與慶大霉素組相比，慶大霉素+艾灸組Bcl-2含量升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Bax含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Bcl-2/Bax含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 各組豚鼠耳蝸Bcl-2/Bax基因轉(zhuǎn)錄水平

2.6 豚鼠血漿血脂水平檢測結(jié)果

與空白組比較，慶大霉素組TG含量降低，慶大霉素+艾灸組TG含量升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CHDL含量降低，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LDL-C含量降低，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與慶大霉素組相比，慶大霉素+艾灸組TG含量升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CHDL含量降低，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LDL-C含量降低，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表6。

表6 三組豚鼠血漿血脂水平

2.7 耳蝸血管紋附近VEGF分布

免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，各組圖片VEGF(綠色)顯色均呈陽性，分布范圍較廣，與上皮細(xì)胞分布范圍基本重合，圖片中可見明顯管腔結(jié)構(gòu)陰影。與空白對照組相比，慶大霉素組耳蝸血管紋周圍組織VEGF蛋白(綠色)熒光強(qiáng)度稍有增強(qiáng)，并可見管腔狀結(jié)構(gòu)；慶大霉素+艾灸組熒光強(qiáng)度比空白組稍有增強(qiáng)，在管腔結(jié)構(gòu)附近熒光強(qiáng)度增加明顯，血管內(nèi)皮附近熒光強(qiáng)度增強(qiáng)最為明顯。見圖2。

注:A：空白組；B:慶大霉素組；C:慶大霉素+艾灸組

3 討論

突發(fā)性耳聾病因復(fù)雜，內(nèi)耳微循環(huán)障礙是突發(fā)性耳聾的常見原因，也是最主要的原因，是內(nèi)耳血管解剖結(jié)構(gòu)與其他致病因素共同影響下的現(xiàn)象產(chǎn)物。各種病理、生理狀態(tài)下的血液流變學(xué)改變均可引起耳蝸微循環(huán)障礙，導(dǎo)致局部缺血缺氧，使得內(nèi)耳神經(jīng)細(xì)胞損傷凋亡是導(dǎo)致突發(fā)的聽力下降的重要原因[2]。突發(fā)性耳聾的病因尚不明確，可能與藥物耳毒性，遺傳因素，情緒因素等諸多因素相關(guān)，通過對這些病因進(jìn)行歸納總結(jié)，發(fā)現(xiàn)其中血管內(nèi)皮損傷，微循環(huán)障礙，毛細(xì)胞凋亡是作為各種原因影響聽力下降的共同重要途經(jīng)[4]，與微循環(huán)障礙，氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系較為密切的指標(biāo)有反應(yīng)過氧化物損傷程度的SOD/MDA，調(diào)節(jié)血管形態(tài)的活性因子NO/ET，與血管內(nèi)皮損傷密切相關(guān)的VEGF，而過氧化反應(yīng)最終損傷線粒體DNA，導(dǎo)致凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)異常，Bcl-2/Bax凋亡軸可反應(yīng)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。目前關(guān)于突發(fā)性耳聾的治療主要以中西醫(yī)結(jié)合治療為主，關(guān)于艾灸等治療方法也有報(bào)道，如范新華等[5]采用針刺結(jié)合艾灸治療突發(fā)性耳聾，采用局部配合遠(yuǎn)端取穴的方法，強(qiáng)調(diào)遠(yuǎn)端取穴的重要性的同時(shí)選取局部的聽宮、聽會(huì)、耳門穴，治療總有效率可達(dá)80%。艾葉本身的化學(xué)成分具有抗炎，抗血凝，抗氧化等多種功效[6]，其燃燒所產(chǎn)生的物理效能可以發(fā)揮其火熱之力，溫?zé)崴幮?，可直接作用于血液系統(tǒng)，優(yōu)化血液成分，還能促進(jìn)微循環(huán)和組織深部的血流灌注[7]作用在局部具有疏通經(jīng)絡(luò)，活血化瘀的作用。且成本低廉，操作方便，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。而對于艾灸療法在突發(fā)性耳聾中的作用機(jī)制目前仍缺乏深入研究。

慶大霉素是則是最有代表性的氨基糖苷類抗生素之一，但它的耳毒性可以給患者帶來不可逆的聽力損傷。氨基糖苷類抗生素也是耳聾的動(dòng)物模型最常用的造模方法之一，它所造成傷害的途徑主要來自于活性氧的生成，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)從而造成對耳蝸毛細(xì)胞、支持細(xì)胞等的損傷，在內(nèi)耳一系列的反應(yīng)中被認(rèn)為是最早的事件在毛細(xì)胞死亡過程中起關(guān)鍵作用[8-9]。王愛梅等[10]的研究顯示，慶大霉素處理后，可以使得耳蝸組織中超氧化物歧化酶活性降低，而使脂質(zhì)氧化物的代謝產(chǎn)物MDA含量增加，證實(shí)了慶大霉素可以提高發(fā)生在內(nèi)耳的氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重過氧化損傷。李明等[11]對氨基糖普類抗生素耳毒性方面的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，慶大霉素對耳蝸的損傷包括藥物在耳蝸內(nèi)的聚集，螺旋神經(jīng)節(jié)血管紋組織細(xì)胞抗氧化機(jī)制的激活，耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)和毛細(xì)胞的凋亡等。慶大霉素所造成的耳毒性與氧化應(yīng)激損傷有明顯相關(guān)性，這與突發(fā)性耳聾的病機(jī)密切相關(guān)，而慶大霉素產(chǎn)生耳毒性的時(shí)間和效果更穩(wěn)定，給了艾灸發(fā)揮治療效果的空間。

SOD與MDA是一組反應(yīng)氧化應(yīng)激損傷的重要指標(biāo)，也是反應(yīng)耳蝸局部微循環(huán)障礙嚴(yán)重程度的重要因子，微循環(huán)障礙的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致耳蝸局部血液供應(yīng)減少，缺血缺氧，使得過氧化物產(chǎn)物局部蓄積[12-13]，結(jié)果顯示，慶大霉素導(dǎo)致了過氧化產(chǎn)物在耳內(nèi)的蓄積，導(dǎo)致耳蝸內(nèi)SOD下降，MDA上升，造成內(nèi)耳的過氧化損傷，艾灸干預(yù)可以上調(diào)SOD含量，下調(diào)MDA含量，從而減少自由基對細(xì)胞膜及線粒體的損傷。NO/ET是一組調(diào)節(jié)血管舒張收縮功能的活性因子，有研究表明機(jī)體在缺血、缺氧等情況下，血管內(nèi)皮受到刺激可釋放大量內(nèi)皮素，進(jìn)而收縮血管加重突發(fā)性耳聾中的微循環(huán)障礙及缺血缺氧[14]，同時(shí)NO還是一種氧自由基清除劑。慶大霉素干預(yù)使得豚鼠血漿內(nèi)皮素ET含量增加，血管收縮，而艾灸的干預(yù)明顯上調(diào)了NO的含量并下調(diào)ET的含量，雖然對于ET的下調(diào)并不顯著，仍可以看出艾灸使得血管擴(kuò)張，并增加了清除氧自由基的能力，改善局部缺氧；而從病理表現(xiàn)來看，慶大霉素組可見耳蝸螺旋韌帶血管紋屈曲變窄，而慶大霉素+艾灸組的血管明顯比慶大霉素組更加粗和流暢，直觀地說明了艾灸可以擴(kuò)張血管，增加局部的血液供應(yīng)量，改善微循環(huán)障礙。

突發(fā)性耳聾聽力下降的根本原因，是缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷及凋亡。研究表明活性氧的蓄積可改變線粒體通透性, 使自由基以及凋亡相關(guān)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),造成線粒體DNA的氧化損傷, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)。而MDA的增加也會(huì)導(dǎo)致線粒體膜流動(dòng)性下降, 使得依賴線粒體膜流動(dòng)性的Ca2+-ATP酶活性下降, 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加, 最終Ca2+超載造成細(xì)胞凋亡[15]。Narrima等[16]和TIAN等[17]的實(shí)驗(yàn)均證實(shí), 細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致Bax增多，Bcl-2減少, 最終細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax是一對凋亡相關(guān)蛋白，是抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程中重要的分子，其促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制己被研究清楚[18]，Bcl-2是一種抗凋亡因子主要通過抑制Ca2+內(nèi)流，穩(wěn)定線粒體膜，抑制線粒體內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白釋放，來達(dá)到控制細(xì)胞凋亡的目的[19]。此外，Bcl-2還可以抑制活性氧對細(xì)胞膜的損害，對細(xì)胞起到保護(hù)作用[20-21]。Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因子，可以破壞線粒體膜的完整性，并與Bcl-2等抑制凋亡的蛋白對抗，阻止其發(fā)揮抗凋亡作用。Bcl-2/Bax凋亡軸的偏倚決定了細(xì)胞是否會(huì)進(jìn)入凋亡程序[22-23]。本次研究發(fā)現(xiàn)，慶大霉素使得耳蝸內(nèi)細(xì)胞凋亡因子BCL2/BAX的升高，而艾灸的干預(yù)下調(diào)了BCL-2/BAX的表達(dá)水平，說明艾灸可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并起到預(yù)方保護(hù)聽力的作用。與聽力表現(xiàn)結(jié)果相符。

VEGF是增加微血管通透性的主要調(diào)節(jié)因子。最新研究認(rèn)為,缺血缺氧為導(dǎo)致VEGF過度表達(dá)的重要因素，通過缺氧誘導(dǎo)因子可上調(diào)VEGF的表達(dá)[24]。而在缺血缺氧發(fā)生時(shí)，VEGF可對神經(jīng)系統(tǒng)具有多重保護(hù)作用,包括血管形成、神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用及抗凋亡等多種機(jī)制[25-27]。本研究中，利用免疫熒光法檢測分析發(fā)現(xiàn)，正常生理?xiàng)l件下VEGF的表達(dá)范圍基本與內(nèi)皮細(xì)胞所在范圍重合，分布較為廣泛，顯色較暗，而與空白組相比，經(jīng)慶大霉素干預(yù)后豚鼠耳蝸血管紋周圍組織VEGF蛋白(綠色)熒光強(qiáng)度略有增強(qiáng)，血管壁附近熒光強(qiáng)度增強(qiáng)不明顯。而對于慶大霉素+艾灸組而言，血管紋周圍組織VEGF蛋白(綠色)熒光強(qiáng)度比空白組稍有增強(qiáng)，且血管內(nèi)皮附近熒光強(qiáng)度升高明顯。本實(shí)驗(yàn)說明艾灸可以上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)的增加，主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可改善血管通透性，防止血栓形成，并影響內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能，進(jìn)而對局部血液成分產(chǎn)生影響，可能為其治療突發(fā)性聾的機(jī)制之一。

而血脂水平三組豚鼠均無顯著差異，說明慶大霉素的耳毒性與血脂代謝無明顯相關(guān)性，以慶大霉素干預(yù)造成豚鼠聽力損傷的模型造模時(shí)間較短，不能體現(xiàn)出對于代謝水平的影響，而艾灸對于脂代謝具有雙向調(diào)節(jié)作用，因而在慶大霉素造模的豚鼠模型中無顯著效果。

本研究結(jié)果表明，慶大霉素的耳毒性可引起內(nèi)耳氧化應(yīng)激反應(yīng)，SOD降低MDA升高，氧自由基的蓄積與對細(xì)胞膜的損傷可影響血管內(nèi)皮的分泌，使得NO水平升高，ET含量降低，造成血管調(diào)控功能異常，加重微循環(huán)障礙，進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激損傷，且低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，還可通過損傷線粒體DNA，引起細(xì)胞凋亡因子BCL2/BAX的升高，進(jìn)而導(dǎo)致毛細(xì)胞損傷凋亡，聽力損傷。艾灸可以增加血管內(nèi)皮上附著的VEGF的含量，增強(qiáng)血管通透性，增加局部血容量，并且艾灸可以導(dǎo)致SOD下調(diào)減輕，MDA上調(diào)減輕，減少了耳蝸局部氧自由基的含量，下調(diào)細(xì)胞凋亡因子BCL2/BAX的水平，最終起到保護(hù)細(xì)胞免于凋亡的作用。說明艾灸改善聽力的作用可能與其活血化瘀與抗氧化的性質(zhì)有關(guān)，局部艾灸可以起到擴(kuò)張血管，并且提高機(jī)體清除自由基的能力，保護(hù)耳蝸組織細(xì)胞和神經(jīng)的功能。但本研究尚未發(fā)現(xiàn)艾灸的溫?zé)嵝?yīng)是否存在副反應(yīng)，及對于不同證型的耳聾是否具有相同的效果，有待后續(xù)深入研究。