王媛媛 邱鵬程 杜洋 鄭淑嫻 薛玉葉 孫光強(qiáng) 陸云陽(yáng) 湯海峰

腦膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是最常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤之一，其特征在于快速生長(zhǎng)和高侵襲性[1]，年發(fā)病率約為(3～6.4)/10萬(wàn)[2]。世界衛(wèi)生組織分類(lèi)系統(tǒng)根據(jù)惡性程度將其分為I～I(xiàn)V級(jí)，屬于惡性級(jí)別較高的為III～I(xiàn)V級(jí)[3-4]。由于膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)性生長(zhǎng)及高復(fù)發(fā)率的臨床特征，在采用手術(shù)切除后放療聯(lián)合替莫唑胺化療等多種治療手段下仍預(yù)后不佳，因此迫切需要尋找新的抗膠質(zhì)瘤藥物[5-7]。

重樓皂苷I(polyphyllin I，PPI)(C44H70O16，又稱(chēng)重樓皂苷D)是中藥重樓的主要成分之一，也是中國(guó)藥典(2020版)規(guī)定的重樓含量檢測(cè)成分之一。重樓皂苷藥理作用有抗菌、抗炎、止血、抗腫瘤等，其中抗腫瘤作用得到了較深入的研究[8]，表明它們對(duì)膀胱癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著抑制作用[9-11]。已有研究證實(shí)重樓皂苷I(D)對(duì)膠質(zhì)瘤具有顯著抑制作用，如：重樓皂苷D通過(guò)Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路誘導(dǎo)U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[12]；重樓皂苷I通過(guò)JNK途徑誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡以及阻滯細(xì)胞周期[13]；通過(guò)分子對(duì)接模擬PPI與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的結(jié)合方式及作用模式，從而驗(yàn)證PPI直接靶向STAT3抑制U251細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[14]；重樓皂苷D誘導(dǎo)Nb-69細(xì)胞凋亡，以及IMR-32和LA-N-2細(xì)胞壞死[15]。高級(jí)別膠質(zhì)瘤具有高度侵襲性，其高度侵襲性表型限制了治療的效果[16-17]。抑制遷移對(duì)腫瘤的侵襲具有重要作用，但PPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文在驗(yàn)證PPI對(duì)膠質(zhì)瘤U373和U251細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上，進(jìn)行PPI抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源

膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞(目錄號(hào)：TCHu 58)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，U373購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，并經(jīng)過(guò)STR鑒定。

1.2 儀器

超凈工作臺(tái)(Thermo Fisher)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(ESCO公司)，IX83倒置顯微鏡(Olympus)，血球計(jì)數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)，Multiskan FC 酶標(biāo)儀(賽默飛公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)，電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)，超純水系統(tǒng)(Heal公司，NW10LVF)，超速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀公司)。

1.3 試藥

重樓皂苷I(寶雞翊瑞生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：AF20052303)，細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)(Elabscience，貨號(hào)：E-CK-A362)，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD，貨號(hào)：556547)，全蛋白提取試劑盒(凱基生物，貨號(hào)：KGP250)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco，貨號(hào)：11965092)，胎牛血清(Biological Industries，貨號(hào)：04-121-1A)，胰蛋白酶(Solarbio，貨號(hào)：T1300)，青鏈霉素混合液(Solarbio，貨號(hào)：P1400)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Elabscience，貨號(hào)：E-BC-K318-M)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天，貨號(hào)：P0012A)；Transwell小室(NEST，批號(hào)：040922ES010410A)；切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved Caspase-3)抗體(Wanleibio，批號(hào)：M12231992)、細(xì)胞色素C(Cytochrome-C，Cyt-C)抗體(Proteintech，貨號(hào)：10993-1-AP)、上皮鈣黏素(E-cadherin，E-cad)抗體(Servicebio，貨號(hào)：GB11868)、白細(xì)胞抑制因子2(drosophila mothers against decapentaplegic 2，Smad2)抗體(Servicebio，貨號(hào)：GB11511)；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(Proteintech，貨號(hào)：20536-1-AP)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體1(Transforming Growth Factor Beta Receptor 1 ，TGF-β R1)抗體(Servicebio公司，貨號(hào)：GB11271)；其他試劑均為分析純。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將U373和U251細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤U373和U251細(xì)胞，鋪于96孔板，1×104個(gè)/孔，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度約為 80%時(shí)使用，PPI以濃度梯度(0.25、0.5、1、2、4、8、16和32 μM)處理24小時(shí)，每個(gè)劑量設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。24小時(shí)后每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育培養(yǎng)2小時(shí)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的光密度(oplical density，OD)值，計(jì)算細(xì)胞抑制率和藥物的半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U373和U251細(xì)胞，接種到6孔板中，2.5×105個(gè)/孔。待細(xì)胞完全貼壁后，以不同劑量PPI(0、3、6 μM)處理24小時(shí)。收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞凋亡雙染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 細(xì)胞劃痕創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U373和U251細(xì)胞，接種到12孔板中，1×105個(gè)/孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，用10 μL移液器的槍頭在每個(gè)孔的中心垂直劃線，用PBS洗滌2次，洗掉劃痕處漂浮細(xì)胞，用不同劑量的PPI(0、1.5、3 μM)處理細(xì)胞，用倒置顯微鏡在不同時(shí)間點(diǎn)拍照(0、24小時(shí))，觀察劃痕處愈合程度，每組實(shí)驗(yàn)隨機(jī)拍照觀察三次。

1.8 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U373和U251細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)(200 μL)細(xì)胞懸液接種到Transwell上室中，下室加入700 μL有血清DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)分別用不同劑量的PPI(0、3和6 μM)進(jìn)行處理，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，取出小室，PBS輕輕清洗2次，用棉簽輕輕擦去上室面細(xì)胞，將小室下表面放在95%乙醇中固定30分鐘，用0.1%結(jié)晶紫染色20分鐘，隨機(jī)視野倒置顯微鏡下觀察拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.9 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U373和U251細(xì)胞中加入不同劑量的PPI(0、3和 6 μM )處理24小時(shí)， PBS緩沖液清洗，胰酶消化后離心，預(yù)冷PBS清洗兩次，加入100 μL Lysis Buffer 裂解液(按照1 mL冷Lysis Buffer加入10 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑和5 μL 100 mM PMSF比例配制裂解液)，輕輕吹打混勻后置于冰上裂解30分鐘，4℃、12000 rpm離心15分鐘，收集上清液。各取20 μL上清液進(jìn)行蛋白定量，按蛋白定量后的其余蛋白樣品的四分之一體積計(jì)算所需5× Loading Buffer緩沖液，并加入原始蛋白樣品中混勻。置于99℃加熱10分鐘使蛋白變性，即為制好的蛋白樣品，可放置于-80℃保存。電泳時(shí)制備5%濃縮膠，8%分離膠，每孔上樣量為5 μL，80 V跑至分離膠4/5處停止，PVDF膜標(biāo)記并用甲醇活化后貼于膠面再于200 mA轉(zhuǎn)膜100分鐘，5%脫脂奶粉封閉1～2小時(shí)，PBST清洗，一抗4℃孵育過(guò)夜。根據(jù)一抗種屬選擇相應(yīng)的二抗，搖床室溫孵育1小時(shí)后，用PBST清洗條帶6次，加入顯色液使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)光顯色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 PPI抑制膠質(zhì)瘤U373和U251細(xì)胞增殖

給予梯度濃度PPI處理24 小時(shí)后，CCK-8實(shí)驗(yàn)表明PPI對(duì)膠質(zhì)瘤U373、U251細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并顯現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。經(jīng)GraphPad Prism 8.0計(jì)算IC50，得出PPI對(duì)U373和U251的 IC50值分別為3.473 μM和2.52 μM(見(jiàn)圖1、表1和表2)。

圖1 PPI劑量依賴(lài)性抑制膠質(zhì)瘤U373和U251細(xì)胞增殖

表1 CCK-8法分析PPI對(duì)膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞抑制率的影響

表2 CCK-8法分析PPI對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞抑制率的影響

2.2 PPI誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U373和U251細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，加藥24小時(shí)后與對(duì)照組相比，隨著PPI給藥濃度的增大膠質(zhì)瘤U373和U251細(xì)胞凋亡率增加，具有明顯的濃度依賴(lài)性(見(jiàn)圖2、表3和表4)。

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373凋亡率的影響

表4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡率的影響

注： B1壞死細(xì)胞；B2晚期凋亡細(xì)胞；B3未發(fā)生調(diào)亡的細(xì)胞；B4早期調(diào)亡。細(xì)胞凋亡率：B2與B4百分率之和。

2.3 PPI抑制膠質(zhì)瘤U373和U251細(xì)胞遷移

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明，PPI不同劑量(0、1.5、3 μM)給藥U373和U251細(xì)胞后，劃痕愈合程度小于空白對(duì)照組(見(jiàn)圖3、表5和表6)；Transwell小室實(shí)驗(yàn)表明，隨著PPI給藥濃度的增加，遷移的細(xì)胞數(shù)量減少，說(shuō)明PPI劑量依賴(lài)性抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移(見(jiàn)圖4、表7和表8)。

表5 PPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373劃痕愈合率的影響

表6 PPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251劃痕愈合率的影響

表7 PPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373遷移個(gè)數(shù)的影響

圖3 PPI給藥1.5 μM和3 μM劑量24小時(shí)抑制U373和U251細(xì)胞劃痕創(chuàng)口愈合(×100)

圖4 PPI給藥3 μM和6 μM劑量抑制U373和U251細(xì)胞遷移(×100)

表8 PPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251遷移個(gè)數(shù)的影響

2.4 PPI對(duì)膠質(zhì)瘤U373和U251細(xì)胞凋亡、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明，PPI上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Cytochrome c的表達(dá)(見(jiàn)圖5和表9)，下調(diào)遷移相關(guān)蛋白TGF-β R1和Smad2的表達(dá)、上調(diào)E-cadherin的表達(dá)(見(jiàn)圖6和表10)。

圖5 PPI上調(diào)U373和U251細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Cytochrome c的表達(dá)

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤之一，具有四高一低的特點(diǎn)，即高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率、高致殘率和低治愈率。目前臨床上神經(jīng)外科手術(shù)是膠質(zhì)瘤的最佳和最直接的治療方法，但因其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)且邊緣不清，導(dǎo)致手術(shù)難以全部切除，易留下瘤根，導(dǎo)致復(fù)發(fā)可能性，所以術(shù)后化療是不可缺少的治療手段[18]。當(dāng)前一線化療藥物為替莫唑胺，但治療效果和患者生存質(zhì)量尚不理想[19]。因此，尋找和開(kāi)發(fā)更有效的藥物來(lái)治療膠質(zhì)瘤迫在眉睫。

圖6 PPI下調(diào)遷移相關(guān)蛋白TGF-β R1和Smad2、

以往對(duì)重樓皂苷I的研究主要為誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，尚未涉及影響膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的相關(guān)研究。Yu Q等[12]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷D可通過(guò)調(diào)節(jié)JNK的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)凋亡；LIU J等[13]通過(guò)驗(yàn)證得出PPI能夠抑制U251細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的G2/M期阻滯和凋亡。鄭彬[20]的研究表明PPI可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制除可能與細(xì)胞線粒體凋亡途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程有關(guān)。以上研究表明PPI誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡涉及多通路、多機(jī)制。

表9 PPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373和U251中凋亡相關(guān)蛋白的影響

表10 PPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373和U251中遷移相關(guān)蛋白的影響

有研究表明，皂苷類(lèi)成分可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增加，導(dǎo)致線粒體膜電位崩潰，伴隨細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)從胞漿的釋放，從而激活半胱天冬酶(caspase)途徑，誘導(dǎo)線粒體途徑凋亡[21-22]。Cyt C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)是細(xì)胞凋亡的一組主要驅(qū)動(dòng)因素，Cleaved Caspase-3為天冬酰胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶，能夠破壞細(xì)胞功能，在細(xì)胞凋亡的早期階段發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用[23]。Cyt C從線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，還可激活切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Cleaved Caspase-9)，并進(jìn)一步導(dǎo)致Cleaved Caspase-3的激活[24]。以往對(duì)PPI誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制研究的報(bào)道中未涉及Cleaved Caspase-3的作用。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示隨著PPI給藥濃度的增大細(xì)胞凋亡率亦增加；Western blot結(jié)果表明PPI上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Cyt C和Cleaved Caspase-3的表達(dá)，表明PPI通過(guò)上述線粒體途徑誘導(dǎo)了膠質(zhì)瘤U373和U251細(xì)胞凋亡。

膠質(zhì)瘤出現(xiàn)侵襲性增強(qiáng)以及腫瘤容易復(fù)發(fā)，與上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生是密切相關(guān)的，最顯著的特征包括細(xì)胞喪失極性和粘附性，并增加侵襲和遷移能力[25]。上皮鈣黏素E-cadherin、TGF-β R1和Smad2均對(duì)EMT具有重要作用。E-cadherin屬于跨膜糖蛋白家族，負(fù)責(zé)鈣依賴(lài)性細(xì)胞間粘附。EMT的一個(gè)標(biāo)志性事件是E-cadherin表達(dá)的減弱或缺失，從而介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[26]。TGF-β/Smad信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等生理過(guò)程，在EMT的經(jīng)典信號(hào)通路中，TGF-β R1可激活Smad2進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移[27-29]。TGF-β R1信號(hào)的下調(diào)被認(rèn)為可以防止腫瘤細(xì)胞中的EMT[30-32]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)劃痕創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)與Transwell小室實(shí)驗(yàn)首次證明PPI可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的能力，Western blot表明分子機(jī)制涉及下調(diào)遷移相關(guān)蛋白TGF-β R1和Smad2，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)。

本文在驗(yàn)證了PPI能夠抑制膠質(zhì)瘤U373和U251細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的基礎(chǔ)上，首次發(fā)現(xiàn)PPI可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移，從而使得對(duì)PPI抗膠質(zhì)瘤作用機(jī)制有了更深入的理解，也為PPI抗膠質(zhì)瘤作用今后的新藥開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。