杜洋 邱鵬程 王媛媛 鄭淑嫻 孫光強(qiáng) 陸云陽(yáng) 薛玉葉 湯海峰

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤多發(fā)生于神經(jīng)外胚層細(xì)胞，是常見(jiàn)的顱腔內(nèi)腫瘤之一，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的26.7%，其發(fā)病率約為5～8/10萬(wàn)，術(shù)后中位生存期不足15個(gè)月[1-2]。發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致殘率高、死亡率高及治愈率低是膠質(zhì)瘤的顯著特征。目前，針對(duì)膠質(zhì)瘤的手術(shù)結(jié)合放化療的綜合治療手段難以避免膠質(zhì)瘤彌漫浸潤(rùn)性和治療抗性的發(fā)生[3-4]。因此，尋找新的治療膠質(zhì)瘤的化療藥物具有十分重要的意義[5]。

天然化合物及其衍生物由于具有結(jié)構(gòu)多樣性特點(diǎn)，在新藥發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用[6]。海星(starfish)是一種無(wú)脊椎海洋動(dòng)物，屬棘皮動(dòng)物門海星綱，《本草綱目》《中華海洋本草》均有海星入藥治病的記載。中醫(yī)認(rèn)為海星具有軟堅(jiān)散結(jié)、清熱解毒的功效，主治甲狀腺腫大，淋巴結(jié)核，癭瘤，瘰疬等癥[7-8]。皂苷是海星最主要也是最重要的次生代謝產(chǎn)物，被稱為海星皂苷(asterosaponin)，具有豐富的結(jié)構(gòu)多樣性，并已被證實(shí)具有抗腫瘤、抗菌、抗?jié)?、神?jīng)保護(hù)、溶血等多種藥理活性，引起了人們的廣泛關(guān)注和研究。鑒于許多天然來(lái)源的皂苷類化合物具有抗膠質(zhì)瘤的功效[9]，課題組對(duì)中國(guó)南海海域的面包海星(Culcitanovaeguineae)開展了化學(xué)研究，從中分離鑒定了一個(gè)具有新穎結(jié)構(gòu)的海星皂苷面包海星3(Culcitanovaeguineae-3，CN-3)(圖1)，發(fā)現(xiàn)其顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，并已證實(shí)CN-3通過(guò)活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)的磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt) 通路誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體凋亡[10]，通過(guò)下調(diào)CUB域EGF樣信號(hào)肽3(signal peptide, CUB domain and EGF like domain containing 3，SCUBE3)導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞G1/S期阻滯[11]。

圖1 CN-3的化學(xué)結(jié)構(gòu)

細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是一種細(xì)胞炎性程序性死亡方式，以質(zhì)膜快速破裂、隨后釋放細(xì)胞內(nèi)容物和炎性物質(zhì)為特征[12]。在焦亡的經(jīng)典途徑中，炎癥小體NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)募集并結(jié)合凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)，導(dǎo)致ASC聚焦，募集剪切型胱天蛋白酶-1(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Cleaved Caspase-1)并激活Caspase-1。Caspase-1參與白細(xì)胞介素-18/1β(interleukin-18/interleukin-1β，IL-18/IL-1β)的切割和成熟以及剪切型gasdermin D蛋白N端(Cleaved N-terminal-gasdermin D， Cleaved N-terminal-GSDMD)的切割。Cleaved N-terminal-GSDMD釋放并在質(zhì)膜中形成孔，導(dǎo)致IL-18/1β的分泌和外液流入，致使細(xì)胞腫脹和滲透性裂解，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡[13-14]。有研究表明，藥物或化合物可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡[12]，焦亡引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞損傷。皂苷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的報(bào)道較少，如重樓皂苷VI誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌焦亡[15]，以及重樓皂苷H誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R細(xì)胞凋亡和焦亡的作用研究[16]。細(xì)胞焦亡參與了腫瘤的免疫調(diào)節(jié)，影響腫瘤進(jìn)展和治療，深入了解細(xì)胞焦亡的機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤治療的新策略[17]。作為海洋來(lái)源的海星皂苷，CN-3是否可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡，尚不知曉。課題組研究發(fā)現(xiàn)在低劑量CN-3處理細(xì)胞后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜呈凸起樣改變，呈現(xiàn)出焦亡的特征。這種現(xiàn)象在海洋來(lái)源皂苷抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的研究中未見(jiàn)報(bào)道，故本文通過(guò)研究CN-3誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡對(duì)其抗膠質(zhì)瘤機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(U251，編號(hào)：1101HUM-PUMC000058)購(gòu)自國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)；腦髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞(LN-229，編號(hào)：CL-0578)購(gòu)自中國(guó)武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 儀器

超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：HeraguardTMECO )，CO2恒溫培養(yǎng)箱(ESCO公司，型號(hào)：CLM-170B-8-NF)，倒置顯微鏡(天津微儀光學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：WYS-37XB)，血球計(jì)數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司，型號(hào)：XB.K.52)，全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：AMR-100)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，型號(hào)：FACSCalibur)，透射電子顯微鏡(JEOL，型號(hào)：JEM-1400)，電泳系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad 公司,型號(hào)：Mini-PROTEAN?)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad 公司，型號(hào)：ChemiDoc XRS+)，微量移液器(BIOHIT公司，Proline)，超純水系統(tǒng)(Heal公司，型號(hào)：NW10LVF)，超速冷凍離心機(jī)(HERMLE,型號(hào)：Z216 MK)，離心機(jī)(湖南赫西儀器有限公司，型號(hào)：TDZ4)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華常州儀器制造有限公司，型號(hào)：HH-3A)等。

1.3 試藥

CN-3[CN-3由實(shí)驗(yàn)室自制，從面包海星中分離純化得到的第3個(gè)海星皂苷，簡(jiǎn)稱為CN-3，純度>99%(HPLC)]，細(xì)胞增殖測(cè)定(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒(Elabscience，貨號(hào)：E-CK-A362)，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD，貨號(hào)：556547)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco，貨號(hào)：11965092)，胎牛血清(Biological Industries，貨號(hào)：04-121-1A)，胰蛋白酶(Solarbio，貨號(hào)：T1300)，青鏈霉素混合液(Solarbio，貨號(hào)：P1400)，Caspase-1抗體 (Proteintech，貨號(hào)：22915-1-AP)、Cleaved Caspase-1抗體(Cell Signaling Technology，貨號(hào)：D5A72)、CleavedN-terminal-GSDMD抗體(abcam，貨號(hào)：ab215203)、pro-IL-1β(萬(wàn)類生物，貨號(hào)：WL02257)、mature-IL-1β抗體(萬(wàn)類生物，貨號(hào)：WL00891)、IL-18抗體(Proteintech，貨號(hào)：10663-1-AP)、NLRP3抗體(Proteintech，貨號(hào)：19771-1-AP)、β-actin 抗體(Proteintech，貨號(hào)：20536-1-AP)，SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒，封閉液，抗體稀釋液，PVDF膜，1×Running Buffer緩沖液粉末(1 L)，1×Transfer Buffer緩沖液粉末(1 L)，全蛋白提取試劑盒，ECL Plus超敏發(fā)光液，山羊抗兔IgG抗體。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

U251細(xì)胞、LN229細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8法檢測(cè)CN-3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率，判定給藥劑量

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞、LN229細(xì)胞，每孔6×103個(gè)接種于96孔板，各設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白組(僅含培養(yǎng)基)，對(duì)照組(含有U251細(xì)胞或LN229細(xì)胞及培養(yǎng)基)及給藥組，給藥組為細(xì)胞及含不同濃度(0.25 μM，0.5 μM，1 μM，2 μM，4 μM，8 μM，16 μM)CN-3藥液的培養(yǎng)基。待細(xì)胞完全貼壁后，加入含不同濃度CN-3藥液的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后，棄上清液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2小時(shí)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞抑制率及IC50值。

1.6 透射電子顯微鏡及倒置顯微鏡觀察細(xì)胞膜形態(tài)變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，PBS洗滌，加入3 μM CN-3藥液培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞，用2%戊二醛溶液固定2小時(shí)，隨后PBS洗滌2次，每次 10分鐘。然后在1% OsO4溶液中固定2小時(shí)。用乙醇梯度脫水后，將細(xì)胞包埋在環(huán)氧樹脂中并切成 50～60 nm 的切片。切片用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。透射電子顯微鏡分析切割樣品。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，PBS洗滌，配置成濃度為3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取混勻的100 μL細(xì)胞懸液加入96孔板中，設(shè)置3個(gè)副孔。待貼壁完全、生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，分對(duì)照組、給藥組，對(duì)照組加培養(yǎng)基，給藥組加含CN-3藥液的培養(yǎng)基至3 μM，12小時(shí)后在倒置顯微鏡40倍下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞焦亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LN229細(xì)胞和U251細(xì)胞，接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)，加入CN-3藥液至不同濃度(0 μM、3 μM、6 μM)，處理12小時(shí)。收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞凋亡雙染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和焦亡率。Annexin V-/PI+表示壞死細(xì)胞，Annexin V+/PI+表示焦亡細(xì)胞，Annexin V+/PI-表示凋亡細(xì)胞，Annexin-V-/PI-表示活細(xì)胞[15]。

1.8 Western Blot法檢測(cè)焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LN229細(xì)胞與U251細(xì)胞，接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)，加入CN-3藥液至不同濃度(0 μM、3 μM、6 μM)，處理24小時(shí)。收集細(xì)胞，用全蛋白提取試劑盒提取蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，制備蛋白樣品，10%聚丙烯胺-SDS凝膠電泳/12%聚丙烯胺-SDS凝膠電泳后冰浴中轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1小時(shí)，加入一抗(1∶1000)4℃孵育過(guò)夜，PBST洗3次，加入二抗(1∶1000)室溫孵育1小時(shí)，PBST洗3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光液后放入全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 CN-3劑量依賴性抑制膠質(zhì)瘤U251及LN229細(xì)胞增殖

采用CCK-8法檢測(cè)給予不同濃度(0.25 μM，0.5 μM，1 μM，2 μM，4 μM，8 μM，16 μM)的CN-3藥液24小時(shí)后細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，CN-3呈劑量依賴性抑制膠質(zhì)瘤U251及LN229細(xì)胞增殖。計(jì)算CN-3對(duì)膠質(zhì)瘤U251及LN229細(xì)胞的抑制率，進(jìn)而計(jì)算CN-3在24小時(shí)抑制U251和LN229細(xì)胞的IC50值分別為4.587 μM與3.066 μM。見(jiàn)表1、表2，圖2。

表1 CCK-8法分析CN-3對(duì)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞的抑制率

表2 CCK-8法分析CN-3對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的抑制率

2.2 CN-3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞膜的影響

在光鏡下可見(jiàn)CN-3低劑量組在濃度為3 μM的藥液處理12小時(shí)時(shí)，與空白對(duì)照組相比，U251細(xì)胞整體形態(tài)出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，細(xì)胞膜發(fā)生腫脹，局部形成凸出物，見(jiàn)圖3(如箭頭所示)。在電鏡下可見(jiàn)CN-3處理后，與空白對(duì)照組相比，U251細(xì)胞膜失去完整性，呈現(xiàn)斷裂、孔隙狀形態(tài)學(xué)改變，見(jiàn)圖4(如箭頭所示)。

注：A CN-3對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞抑制率圖；B CN-3對(duì)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞抑制率圖

注：A 空白對(duì)照組12小時(shí)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞成像圖；B CN-3低劑量組(3 μM)12小時(shí)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞成像圖

注：A 空白對(duì)照組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞12000×視野電鏡圖； B 空白對(duì)照組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞30000×視野電鏡； C CN-3低劑量組(3 μM)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞12000×視野電鏡圖； D CN-3低劑量組(3 μM)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞30000×視野電鏡圖。

2.3 CN-3誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251和LN229細(xì)胞凋亡與焦亡

使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)量不同濃度CN-3處理的LN229和U251細(xì)胞凋亡與焦亡的變化。Annexin V-/PI+表示壞死細(xì)胞，Annexin V+/PI+ 表示發(fā)生焦亡細(xì)胞，Annexin V+/PI-表示凋亡細(xì)胞，Annexin V-/PI- 表示活細(xì)胞[15]。數(shù)據(jù)表顯示焦亡細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的百分比。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，3 μM的CN-3藥液處理12小時(shí)后U251和LN229細(xì)胞主要表現(xiàn)出焦亡，6 μM的CN-3藥液處理12小時(shí)后U251和LN229細(xì)胞的凋亡比例上升，見(jiàn)圖5，表3、表4。

2.4 CN-3上調(diào)膠質(zhì)瘤U251和LN229細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

通過(guò)Western blot法驗(yàn)證了CN-3誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251和LN229細(xì)胞通過(guò)Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典途徑誘導(dǎo)焦亡的發(fā)生。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，CN-3增加了U251和LN229細(xì)胞中NLRP3、 Cleaved Caspase-1、CleavedN-terminal-GSDMD和IL-1β蛋白的表達(dá)水平，見(jiàn)圖6、圖7，表5、表6。

圖6 CN-3對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞焦亡NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖7 CN-3對(duì)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞焦亡NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CN-3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN229的影響

表4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CN-3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的影響

表5 CN-3對(duì)各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中焦亡相關(guān)蛋白的影響

注：橫坐標(biāo)代表Annexin V-FITC ,縱坐標(biāo)代表PI。Annexin V-/PI+表示壞死細(xì)胞，Annexin V+/PI+ 表示發(fā)生焦亡細(xì)胞，Annexin V+/PI-表示早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-/PI- 表示活細(xì)胞

表6 CN-3對(duì)各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN229中焦亡相關(guān)蛋白的影響

3 討論

《中國(guó)中藥資源志要》中記載海星味咸，性平，用于癭瘤[18]。海星皂苷抗腫瘤作用機(jī)制復(fù)雜，可通過(guò)誘導(dǎo)線粒體凋亡、周期阻滯等抑制膠質(zhì)瘤的增殖。但皂苷誘導(dǎo)焦亡相關(guān)研究較少。本文首次發(fā)現(xiàn)了海洋來(lái)源的海星皂苷CN-3誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡。焦亡發(fā)生的過(guò)程中，在藥物作用下，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體(NLR)識(shí)別信號(hào)，通過(guò)接頭蛋白ASC與Caspase-1結(jié)合，形成多蛋白復(fù)合物，激活Caspase-1，活化的Caspase-1切割激活GSDMD，誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔、細(xì)胞破裂、內(nèi)容物釋放，并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡以響應(yīng)腫瘤化療藥物[19-20]；此外，活化的Caspase-1對(duì)pro-IL-1β和pro-IL-18進(jìn)行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，募集和激活其他免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)趨化因子、炎癥因子、粘附分子等的合成，最終引起級(jí)聯(lián)效應(yīng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[21]。最新研究表明，細(xì)胞焦亡具有促進(jìn)和抑制腫瘤形成的雙重作用[22]。然而，膠質(zhì)瘤發(fā)生細(xì)胞焦亡的具體機(jī)制以及海星皂苷誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡的預(yù)后價(jià)值仍不清楚。

本研究采用CCK-8法檢測(cè)CN-3抑制膠質(zhì)瘤U251和LN229細(xì)胞增殖。與空白對(duì)照組相比，低劑量CN-3組在光鏡與電鏡下，膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞膜突起，孔隙形成、質(zhì)膜破裂等具有焦亡特征的形態(tài)學(xué)改變。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了各組中焦亡細(xì)胞與早期凋亡細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)低劑量CN-3處理后，膠質(zhì)瘤U251和LN229細(xì)胞發(fā)生焦亡的細(xì)胞比例較高，而在高劑量CN-3處理后凋亡細(xì)胞比例上升。這表明CN-3可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251和LN229細(xì)胞焦亡，并且不同劑量CN-3發(fā)揮的抗膠質(zhì)瘤作用機(jī)制可能不盡相同。Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，CN-3可顯著上調(diào)膠質(zhì)瘤U251和LN229細(xì)胞中Cleaved Caspase-1、CleavedN-terminal-GSDMD、mature-IL-1β和NLRP3蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡。提示CN-3可通過(guò)NLRP3/Casapse-1/GSDMD經(jīng)典通路誘導(dǎo)焦亡發(fā)生。

本文主要發(fā)現(xiàn)低濃度CN-3作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，可首先誘發(fā)經(jīng)典焦亡途徑發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞的功能，從而使得對(duì)皂苷抗膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制有了更深入的理解，也為抗膠質(zhì)瘤皂苷CN-3今后的新藥開發(fā)及臨床應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。