王嘯洋 衛(wèi)柯 陸云陽 佟菲 張艷華 湯海峰
毛茛科(Ranuneulaeeae)鐵線蓮屬(Clematis)植物在全世界有370余種,中國約產(chǎn)170種(含變種),全國各地均有分布,以西南和華中地區(qū)居多[1-10]。該屬在中國民間作為藥用的有77種[11],其中川木通(小木通或繡球藤的干燥藤莖)[12]和威靈仙(威靈仙、棉團鐵線蓮或東北鐵線蓮的干燥根莖)[12]為《中國藥典》2020版收錄品種,其他常見的藥用品種有百部仙靈(圓錐鐵線蓮)、黑腳威靈仙(柱果鐵線蓮)、大木通(鈍齒鐵線蓮)、小木通(毛蕊鐵線蓮)等,多具有祛風除濕、消腫止痛、舒筋活血、利尿通淋、痛經(jīng)下乳等功效[13]。現(xiàn)代藥學研究表明,本屬植物含有三萜皂苷、黃酮、香豆素、木脂素、生物堿等化學成分,具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等藥理作用[14-15]。課題組前期已對多種鐵線蓮屬植物進行了化學成分和藥理作用研究,分離鑒定了三萜皂苷、黃酮、木脂素等多種成分,其中部分化合物顯示顯著抗腫瘤、抗炎、抗心肌缺血等藥理活性[16-21]。美花鐵線蓮(Clematispotaninii)分布于西藏、云南、四川、甘肅、陜西等地,以莖入藥,有祛風濕、清肺熱、止痢、消食等功效[1]。在前期研究基礎(chǔ)上[20],本文繼續(xù)報道對該植物莖乙醇提取物正丁醇萃取部位化學成分的研究工作,為該植物的進一步開發(fā)研究提供理論依據(jù)。
液相色譜儀為Dionex P680型(美國Dionex公司),配YMC-Pack R&D ODS-A半制備液相色譜柱(20 × 250 mm,5 μm,日本YMC公司);質(zhì)譜儀為Micromass Quattro(美國Waters公司);氣相色譜儀為Finnigan Voyager(美國Finnigan公司),配L-Chirasil-Val氣相色譜柱(25 m × 0.32 mm,0.25 μm,美國Agilent公司);旋光儀為Perkin-Elmer 341型(美國Perkin-Elmer公司);核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)儀為Bruker AVANCE-500型(瑞士Bruker公司)。柱色譜與薄層色譜硅膠(青島海洋化工廠),反相柱色譜硅膠(ODS-A,日本YMC公司),Sephadex LH-20凝膠柱色譜填料(瑞典GE公司),色譜純甲醇(天津科密歐化學試劑公司),其他分析純試劑(天津富宇精細化工公司),水為純凈水。
藥材于2015年8月采自陜西省秦嶺太白山區(qū)域,經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學藥學院生藥教研室王繼濤教授鑒定為毛茛科鐵線蓮屬美花鐵線蓮Clematispotaninii的莖,標本(20150813)存于空軍軍醫(yī)大學藥學系中藥與天然藥物學教研室。
取美花鐵線蓮的干燥莖7.5 kg,粉碎成粗粉,加入3倍量70%乙醇加熱回流提取3次(每次2小時),合并提取液,減壓濃縮得481 g浸膏,浸膏用5 L水分散,依次用等體積石油醚和水飽和正丁醇萃取4次,得正丁醇萃取物170 g。正丁醇萃取物用硅膠柱色譜進行分離,三氯甲烷—甲醇—水(50∶1∶0 ~ 65∶35∶5)梯度洗脫,經(jīng)薄層色譜檢識合并,得到Fr.1~Fr.4四個流份。
Fr.1(4.5 g)用硅膠柱色譜分離,三氯甲烷—甲醇—水(9∶1∶0.02 ~ 8∶2∶0.08)梯度洗脫,得Fr.1.1~Fr.1.6,F(xiàn)r.1.2和Fr.1.4經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(三氯甲烷—甲醇 = 1∶1)分離得Fr.1.2.1~Fr.1.2.8和Fr.1.4.1~Fr.1.4.6;Fr.1.2.3~Fr.1.2.5合并后經(jīng)重結(jié)晶得到化合物1(56.0 mg),F(xiàn)r.1.4.3~Fr.1.4.5合并后經(jīng)重結(jié)晶得到化合物2(134.0 mg)。
Fr.2(14.2 g)用硅膠柱色譜分離,三氯甲烷—甲醇—水(9∶1∶0.02~8∶2∶0.08)梯度洗脫,得Fr.2.1~Fr.2.5,F(xiàn)r.2.4經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(三氯甲烷—甲醇=1∶1)分離得Fr.2.4.1~Fr.2.4.8,從Fr.2.4.3~Fr.2.4.6合并液中析出白色粉末狀物質(zhì),為化合物3(45.6 mg)。
Fr.3(26.4 g)用硅膠柱色譜分離,三氯甲烷—甲醇—水(9∶1∶0.02~7∶3∶0.10)梯度洗脫,得Fr.3.1~Fr.3.6,F(xiàn)r.3.2經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(三氯甲烷—甲醇=1∶1)除去水溶性雜質(zhì)后,用反相ODS柱色譜分離,甲醇—水(3∶7~10∶0)梯度洗脫,得Fr.3.2.1~Fr.3.2.5;其中Fr.3.2.2用半制備高效液相色譜(semi-preparative high performance liquid chromatography,Semi-Prep HPLC)分離(甲醇—水=30∶70),得化合物4(200.0 mg,tR9.3分鐘)、化合物5(90.0 mg,tR12.5分鐘)和化合物6(20.6 mg,tR14.5分鐘)。
Fr.4(42.5g)用硅膠柱色譜分離,三氯甲烷—甲醇—水(9∶1∶0.02~6∶4∶0.5)梯度洗脫,得到Fr.4.1~Fr.4.8,F(xiàn)r.4.2用Sephadex LH-20凝膠柱色譜(三氯甲烷—甲醇=1∶1)除去水溶性雜質(zhì)后,經(jīng)反相ODS柱色譜分離,甲醇—水(2∶8~10∶0)梯度洗脫,得Fr.4.2.1~Fr.4.2.6,其中Fr.4.2.2用Semi-Prep HPLC純化(甲醇—水=55∶45),得化合物7(122.8 mg,tR8.6分鐘)和化合物8(90.2 mg,tR13.7分鐘)。
稱取待測化合物5 mg,加入5 mL三氟乙酸溶液(2 mol/L),密閉反應8小時(110 ℃);反應后靜置放冷,加入20 mL 純凈水,等體積乙酸乙酯萃取3次,合并水層,濃縮蒸干所得殘余物與2 mgL-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽溶于2 mL吡啶,于60 ℃水浴中反應1小時,反應完畢后用氮氣吹干;向殘余物中加入0.2 mLN-(三甲基硅基)咪唑和2 mL吡啶,60 ℃水浴反應1小時,氮氣吹干;殘余物用水分散,用等體積環(huán)己烷萃取3次,蒸干得糖基的三甲基硅醚化衍生物。
對衍生物進行氣相色譜(gas chromatography,GC)分析,載氣:氮氣;進樣量:1 μL;檢測器溫度:280 ℃;氣化溫度:250 ℃;程序升溫:初始柱溫為140 ℃,保持5分鐘,以2 ℃/分鐘的速度升溫到180 ℃,保持5分鐘,再以10 ℃/分鐘的速升溫到320 ℃,保持10分鐘。標準糖用上述同樣方法衍生并進行分析,根據(jù)樣品保留時間和峰面積來確定化合物中的糖基種類和含量比例。
按照1.2所述方法步驟,從美花鐵線蓮莖乙醇提取物的正丁醇萃取部位共分離鑒定了8個化合物1~8,包括4個三萜類(化合物1、2、7和8)、1個甾醇苷類(化合物3)和3個木脂素類(化合物4、5和6)化合物(圖1),所有化合物均為首次從本植物中得到,4為首次從本屬植物中發(fā)現(xiàn)。
白色針晶,易溶于三氯甲烷,m.p. 256~258℃,Libermann-Burchard反應呈陽性,濃硫酸乙醇溶液(體積分數(shù)10%)中顯紫色。電噴霧質(zhì)譜(Electro Spray Ionization-Mass Spectroscopy,ESI-MS)給出[M+Na]+m/z449,結(jié)合其13C-NMR(125 MHz, CDCl3)數(shù)據(jù)推測分子式為C30H50O。該化合物的1H-NMR(500 MHz, CDCl3)給出8個三萜類化合物的特征甲基質(zhì)子信號:δH0.72 (3H,s,H-24),0.85 (3H,s,H-25),0.86 (3H,d,J=6.5Hz,H-23),0.94 (3H,s,H-29),0.99 (3H,s,H-30),1.00 (3H,s, H-26),1.03 (3H,s,H-27)和1.17 (3H,s,H-28)。
13C-NMR譜及DEPT譜給出30個碳信號,包括8個甲基碳信號、11個亞甲基碳信號、5個次甲基碳信號和6個季碳信號(含1個羰基碳信號),具體如下:δC22.0 (C-1),41.1 (C-2),212.8 (C-3),57.9 (C-4),41.8 (C-5),41.0 (C-6),18.0 (C-7),52.8 (C-8),37.1 (C-9),59.2 (C-10),35.4 (C-11),30.2 (C-12),39.4( C-13),38.0 (C-14),32.5 (C-15),35.7 (C-16),29.7 (C-17),42.5 (C-18),35.1 (C-19),28.0 (C-20),32.2 (C-21),39.0 (C-22),6.6 (C-23),14.4 (C-24),17.6 (C-25),20.0 (C-26),18.3 (C-27),31.8 (C-28),31.5 (C-29),34.8 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[22],故鑒定該化合物為木栓酮。
圖1 從美花鐵線蓮中分離到的化合物1~8的化學結(jié)構(gòu)
白色針晶,易溶于三氯甲烷,m.p. 284~287℃,Libermann-Burchard反應呈陽性,濃硫酸乙醇溶液(體積分數(shù)10%)中顯紫色。ESI-MS給出[M+Na]+m/z451,結(jié)合其13C-NMR(125 MHz, CDCl3)譜推測分子式為C30H52O。該化合物的1H-NMR(500 MHz, CDCl3)給出8個三萜類化合物的特征甲基質(zhì)子信號:δH0.86 (3H,s,H-24),0.92 (3H,s,H-23),0.94 (3H,s,H-25),0.96 (3H,s,H-30),0.99 (3H,s,H-29),1.01 (3H,s, H-26),1.02 (3H,s,H-27)和1.15 (3H,s,H-28),1個特征的次甲基質(zhì)子信號δH3.71 (1H,br s,H-3)。
13C-NMR譜及DEPT譜顯示,化合物2比化合物1少1個羰基碳信號,多出1個連氧的次甲基碳信號,且化學位移差別主要在A環(huán),具體如下:δC15.6 (C-1),32.2 (C-2),72.6 (C-3),49.0 (C-4),36.8 (C-5),41.7 (C-6),17.4 (C-7),53.0 (C-8),38.2 (C-9),61.2 (C-10),35.4 (C-11),30.5 (C-12),37.7 (C-13),39.5 (C-14),32.8 (C-15),36.0 (C-16),29.8 (C-17),42.7 (C-18),35.2 (C-19),28.0 (C-20),35.0 (C-21),39.1 (C-22),11.5 (C-23),16.2 (C-24),18.1 (C-25),18.5 (C-26),20.0 (C-27),31.9 (C-28),34.8 (C-29),31.6 (C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[23],故鑒定該化合物為表木栓醇。
白色無定形粉末,m.p. 284~286℃,Libermann-Burchard和Molish反應呈陽性,濃硫酸乙醇溶液(體積分數(shù)10%)中顯紫色。以3種TLC展開系統(tǒng)(石油醚—丙酮、環(huán)己烷—乙酸乙酯和三氯甲烷—甲醇)展開,與β-胡蘿卜苷對照品的Rf值和顯色反應一致,并且與對照品混合熔點不下降,推測其為β-胡蘿卜苷。
該化合物的13C-NMR譜(125 MHz, C5D5N) 數(shù)據(jù)為δC: 37.6 (C-1),30.3 (C-2),78.4 (C-3),39.8 (C-4),140.8 (C-5),121.7 (C-6),32.3 (C-7),32.0 (C-8),50.4 (C-9),36.7 (C-10),21.1 (C-11),39.2 (C-12),42.4 (C-13),56.7 (C-14),24.5 (C-15),28.6 (C-16),56.4 (C-17),12.1 (C-18),19.3 (C-19),36.3 (C-20),19.1 (C-21),34.4 (C-22),26.5 (C-23),46.0 (C-24),29.5 (C-25),19.9 (C-26),19.4 (C-27),23.5 (C-28),12.1 (C-29),Glc (葡萄糖)C-1~C-6 (102.5,75.4,78.4,71.8,78.1,62.9),與文獻數(shù)據(jù)基本一致[24],故鑒定該化合物為β-胡蘿卜苷。
該化合物13C-NMR譜及DEPT譜給出26個碳信號,包括12個隸屬于兩個芳環(huán)的碳信號、6個隸屬于六碳糖的碳信號、2個甲氧基碳信號、2個羥甲基碳信號、2個亞甲基碳信號和2個次甲基碳信號,具體如下:δC116.8 (C-1),146.7 (C-2),146.3 (C-3),113.9 (C-4),36.3 (C-5),44.7 (C-6),61.5 (C-6a),45.0 (C-7),61.6 (C-7a),36.3 (C-8),136.7 (C-9),123.0 (C-10),133.5 (C-1’),114.5 (C-2’),150.7 (C-3’),149.1 (C-4’),116.7 (C-5’),122.5 (C-6’),Glc C-1~C-6 (103.1,75.4,79.0,71.7,79.3,62.8),56.3 (3’-OCH3),56.3 (4’-OCH3)。以上信息提示化合物4為由兩個苯丙素類分子及一分子葡萄糖組成的木脂素苷類化合物,波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[25],故鑒定該化合物為sargentodoside D。
該化合物的13C-NMR譜及DEPT譜給出32個碳信號,包括12個隸屬于兩個芳環(huán)的碳信號、12個隸屬于兩組六碳糖的碳信號、2個甲氧基碳信號、1個羥甲基碳信號、2個亞甲基碳信號和3個次甲基碳信號,具體如下:δC139.4 (C-1),111.5 (C-2),149.9 (C-3),147.6 (C-4),116.6 (C-5),119.3 (C-6),83.7 (C-7),54.3 (C-8),60.5 (C-9),135.6 (C-1'),114.2 (C-2'),150.7 (C-3'),146.9 (C-4'),116.9 (C-5'),121.7 (C-6'),33.8 (C-7'),43.5 (C-8'),73.7 (C-9'),Glc I C-1~C-6 (102.8,75.4,79.0,71.7,79.3,62.8),Glc II C-1~C-6 (102.9,75.4,79.1,71.7,79.3,62.9),56.4 (3’-OCH3),56.4 (4’-OCH3)。以上信息提示化合物5為由兩個苯丙素類分子及兩分子葡萄糖組成的木脂素苷類化合物,波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[26],故鑒定該化合物為落葉松脂醇-4,4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
分析13C-NMR譜及DEPT譜數(shù)據(jù),化合物6比化合物5少1組六碳糖碳信號,具體如下:δC139.3 (C-1),111.2 (C-2),149.7 (C-3),47.5 (C-4),116.3 (C-5),119.2 (C-6),83.7 (C-7),54.3 (C-8),60.2 (C-9),135.6 (C-1’),114.2 (C-2’),150.6 (C-3’),146.7 (C-4’),116.8 (C-5’),121.5 (C-6’),33.7 (C-7’),43.3 (C-8’),73.5 (C-9’),Glc C-1~C-6 (102.8,75.3,79.1,71.1,79.3,62.9),56.3 (3’-OCH3),56.4 (4’-OCH3)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[26],故鑒定該化合物為落葉松脂醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
1H-NMR給出6個苷元甲基質(zhì)子信號:δH0.84 (3H,s,H-29),0.85 (3H,s,H-30),0.96 (3H,s,H-25),1.05 (3H,s,H-26),1.12 (3H,s,H-24)和1.15 (3H,s,H-27);6個糖端基質(zhì)子信號:δH4.95 (1H,d,J=8.0 Hz,Glc II H-1),5.08 (1H,d,J=6.2 Hz,Ara H-1),5.15 (1H,d,J=8.0 Hz,Xyl H-1),5.86 (1H,s,28-O-Rha H-1),6.23 (1H,d,J= 8.2 Hz,Glc I H-1)和6.35 (1H,s,3-O-Rha H-1);3-O-Rha和28-O-Rha上的甲基質(zhì)子信號分別為:δH1.51 (3H,d,J=6.2 Hz)和1.67 (3H,d,J=6.1 Hz);苷元特征質(zhì)子信號:δH3.12 (1H,dd,J=3.6,13.2 Hz,H-18)和5.34 (1H,br s,H-12)。
13C-NMR給出δC:39.2 (C-1),26.9 (C-2),81.3 (C-3),44.0 (C-4),48.2 (C-5),18.6 (C-6),33.2 (C-7),40.4 (C-8),48.5 (C-9),37.3 (C-10),24.1 (C-11),123.2 (C-12),144.4 (C-13),42.4 (C-14),28.6 (C-15),23.7 (C-16),47.5 (C-17),42.0 (C-18),46.7 (C-19),31.2 (C-20),34.3 (C-21),33.2 (C-22),64.3 (C-23),14.3 (C-24),16.5 (C-25),17.9 (C-26),26.4 (C-27),176.9( C-28),33.5 (C-29),24.2 (C-30),Ara C-1~C-5 (105.1,76.0,75.5,69.9,66.4),3-O-Rha C-1~C-6 (101.7,72.4,83.1,73.5,70.3,18.8),Xyl C-1~C-5 (107.6,76.0,78.9,71.6,67.9),Glc I C-1~C-5 (96.0,74.4,79.1,71.2,78.7,69.6),Glc II C-1~C-6 (105.1,75.7,76.6,78.7,77.4,61.6),28-O-Rha C-1~C-6 (103.1,72.8,73.2,74.2,70.6,18.7)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[29],故鑒定該化合物為sieboldnoside A。
1H-NMR給出7個苷元甲基質(zhì)子信號:δH0.87 (3H,s,H-25),0.90 (3H,s,H-30),0.91(3H,s,H-29),1.08 (3H,s,H-26),1.15 (3H,s,H-24),1.26 (3H,s,H-27)和1.32 (3H,s,H-23);6個糖端基質(zhì)子信號:δH4.98 (1H,d,J=7.9 Hz,Glc II H-1),5.05 (1H,d,J=8.0 Hz,Xyl H-1),5.95 (1H,d,J=4.0 Hz,Rib H-1),5.86 (1H,s,28-O-Rha H-1),6.23 (1H,d,J= 8.5 Hz,Glc I H-1)和6.32 (1H,s,3-O-Rha H-1);3-O-Rha和28-O-Rha上的甲基質(zhì)子信號分別為:δH1.52 (3H,d,J=6.2 Hz)和1.67 (3H,d,J=6.2 Hz);苷元特征質(zhì)子信號:δH3.14 (1H,dd,J=3.6,13.2 Hz,H-18),3.25 (1H,dd,J=4.2,11.8 Hz,H-18)和5.37 (1H,br s,H-12)。
13C-NMR給出δC:39.3 (C-1),27.0 (C-2),89.1 (C-3),39.9 (C-4),56.4 (C-5),18.8 (C-6),33.3 (C-7),40.3 (C-8),48.5 (C-9),37.4 (C-10),24.2 (C-11),123.2 (C-12),144.4 (C-13),42.5 (C-14),28.6 (C-15),23.7 (C-16),47.3 (C-17),42.0 (C-18),46.6 (C-19),31.1 (C-20),34.3 (C-21),32.9 (C-22),28.5 (C-23),17.6 (C-24),16.1 (C-25),17.8 (C-26),26.4 (C-27),176.9 (C-28),33.4 (C-29),24.1 (C-30),Rib C-1~C-5 (105.0,73.2,69.5,70.9,65.6),Xyl C-1~C-5 (105.7,77.3,80.2,72.0,67.4),3-O-Rha C-1~C-6 (101.8,72.3,81.6,73.1,70.2,18.9),Glc I C-1~C-5 (96.0,74.2,79.0,71.1,78.7,69.6),Glc II C-1~C-6 (105.1,75.7,76.5,78.7,77.3,61.5),28-O-Rha C-1~C-6 (103.1,72.9,73.2,74.3,70.7,18.5)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[32],故鑒定該化合物為huzhangoside C。
王文采院士等[2]于2005年建立了新的鐵線蓮屬分類系統(tǒng),認為該屬包含4個亞屬15組共355種,在此之后,繼續(xù)對該屬品種進行擴展和修訂[3-10],現(xiàn)已達到370余種,中國約產(chǎn)170種。據(jù)《中國中藥資源志要》記載[11],在毛茛科植物中,鐵線蓮屬供藥用品種數(shù)(77種)僅次于烏頭屬(82種),已有29個少數(shù)民族將其作為藥用[13]??梢?,本屬植物物種豐富,可供藥用品種多,《藥典》中收錄的威靈仙和川木通,其基原植物分別為3種和2種,在實際使用中混用現(xiàn)象較為嚴重。不同民族對本屬植物的藥用部位和對應的功能主治也存在較大差別。目前,國內(nèi)外學者已對20余種本屬植物進行過化學成分和藥理作用的相關(guān)研究,不及本屬品種總數(shù)十分之一,這些研究表明三萜皂苷、黃酮和木脂素是發(fā)揮藥效的主要活性成分,但上述成分所發(fā)揮的藥理作用不盡相同,這也是造成在不同民族藥用時功能主治差異的主要原因。因此,有必要進一步拓展本屬植物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究,為民族用藥功效的內(nèi)涵提供科學闡釋。
本課題組為首個開展美花鐵線蓮化學成分研究的團隊,本研究在前期工作基礎(chǔ)上,綜合運用多種色譜分離手段,從該植物的乙醇提取物正丁醇萃取部位分離純化得到8個化合物,根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)鑒定了它們的化學結(jié)構(gòu),包括4個三萜類、1個甾醇苷類和3個木脂素類化合物,其中化合物1和化合物2為木栓烷型三萜,化合物7和化合物8為齊墩果烷型三萜皂苷,胡蘿卜苷(化合物3)為廣泛存在的植物甾醇苷,化合物4為二芐基丁烷型木脂素苷,化合物5和化合物6均為四氫呋喃型木脂素苷,所有化合物均為首次從本植物中分離得到,化合物4為首次從本屬分離得到,且所有化合物得量較高,為下一步的藥理活性研究提供了保障。本研究結(jié)果豐富了鐵線蓮屬植物藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為本植物的進一步開發(fā)利用提供了實驗依據(jù),可為本屬植物間的相互替代用藥和藥效闡釋提供參考。