田韻遠(yuǎn) 樊培 陸云陽(yáng) 劉楊 陳文文 胡晉銘 曹宇 袁曉峰 李天怡 湯海峰

中藥重樓為百合科(Liliaceae)重樓屬植物云南重樓[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.]和七葉一枝花[P.polyphyllaSmithvar.chenensis(Franch.) Hara]的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛和涼肝定驚的功效[1]。云南白藥、熱毒清片和宮血寧膠囊等多種中成藥的主要藥材均為重樓。對(duì)重樓屬植物化學(xué)成分的研究始于60年代初，黃偉光等[2]從云南重樓中分離得到薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元。近年來(lái)，對(duì)中藥重樓化學(xué)成分和藥理作用的研究報(bào)道越來(lái)越多，研究表明重樓的主要藥效成分是甾體皂苷，亦總稱(chēng)為重樓皂苷，具有抗腫瘤、抗菌、抗心肌缺血、抗氧化等多方面的生物活性[3-5]。重樓的藥用價(jià)值被不斷發(fā)掘，基源植物被大量采摘，且該植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、自然更替緩慢，使得其自然資源嚴(yán)重緊缺，出現(xiàn)了供不應(yīng)求的現(xiàn)象，價(jià)格連年攀升[6-7]。在廣泛開(kāi)展重樓人工培育的同時(shí)，從民族民間藥特別是重樓屬其他植物中尋找新的替代資源是解決其資源匱乏的重要途徑。

巴山重樓(Parisbashanensis)主要分布于湖北、重慶和四川等地，經(jīng)作者考察，在陜南亦有分布。巴山重樓的根莖是土家族的常用藥材，被稱(chēng)為“露水珠”，具有散寒祛濕、通絡(luò)止痛和止血生津的功效，主要用于頭痛、痢疾和毒蟲(chóng)咬傷等疾病的治療[8-9]。目前，包括本課題組的研究工作在內(nèi)[10]，僅報(bào)道從巴山重樓中分離鑒定了19個(gè)化合物[11-12]，對(duì)其化學(xué)成分的研究不夠充分，有待進(jìn)一步闡明其所含化學(xué)成分。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，繼續(xù)報(bào)道對(duì)巴山重樓根莖中甾體皂苷類(lèi)化學(xué)成分的研究工作，進(jìn)一步開(kāi)展其皂苷類(lèi)成分的研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Quatrro Micro質(zhì)譜儀(Micromass公司)；Bruker AVANCE 800型核磁共振波譜儀(Bruker公司)；戴安P680高效液相色譜儀(P680系列單泵、UV-VS 檢測(cè)器、CHROMELON工作站)[配YMC-Pack R&D ODS-A半制備色譜柱(20 mm × 250 mm，5 μm)]；Agilent GC-6820氣相色譜儀[配HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(30 m × 0.32 mm，0.25 μm)，氫火焰離子化檢測(cè)器]；ODS C18柱(Pharmacia公司)；Sephadex LH-20凝膠(GE公司)；柱色譜硅膠(100～200目、200～300目)、薄層色譜用硅膠H、預(yù)制硅膠板G(青島海洋化工廠)；RP-18高效薄層預(yù)制板(Merck公司)。色譜純甲醇(天津科密歐公司)；氘代試劑(Merck公司)；標(biāo)準(zhǔn)品D-葡萄糖(D-glucose, D-Glc)、L-鼠李糖(L-rhamnose, L-Rha)和D-半乳糖(D-galactose, D-Gal)(Sigma公司，純度≥ 99%)；顯色劑(10%硫酸/乙醇溶液)；其他試劑均為分析純。

藥材于2018年9月采自陜西省安康市鎮(zhèn)坪縣，經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室湯海峰教授鑒定為巴山重樓(ParisbashanensisWang et Tang)的根莖，藥材標(biāo)本(編號(hào)：20189013)保存在空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室標(biāo)本室。

1.2 化學(xué)成分的提取與分離

干燥的巴山重樓根莖0.8 kg，用70%乙醇浸泡過(guò)夜，加熱回流提取5次，每次2小時(shí)，減壓回收溶劑得醇提浸膏210 g。將浸膏加適量水分散，用等體積石油醚萃取5次，再用等體積水飽和正丁醇萃取6次，合并回收正丁醇層得到總皂苷160 g。所得總皂苷經(jīng)硅膠柱色譜，用V二氯甲烷∶V甲醇∶V水(80∶1∶0 ～ 65∶35∶10)為洗脫劑梯度洗脫，合并得到25個(gè)組分(Fr.1 ～ Fr.25)。根據(jù)薄層色譜展開(kāi)情況，選取Fr.6、Fr.8、Fr.11、Fr.12和Fr.13分別經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(洗脫劑為甲醇)除去水溶性雜質(zhì)后，再經(jīng)反相硅膠柱色譜，以V甲醇∶V水(80∶20 ～ 40∶60, v/v)梯度洗脫，得到Fr.6-2-1、Fr.8-3-2、Fr.11-1-1、Fr.12-1-1和Fr.13-2-1。Fr.6-2-1以60%乙腈為流動(dòng)相，通過(guò)半制備高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)；流速10 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm(以下色譜條件均相同)，分離得到化合物3(9.5 mg)、7(7.9 mg)和Fr.6-2-1-2，F(xiàn)r.6-2-1-2以50%乙腈為流動(dòng)相，通過(guò)半制備HPLC純化得到化合物1(16.9 mg)。Fr.8-3-2以55%乙腈為流動(dòng)相，通過(guò)半制備HPLC純化得到化合物6(35 mg)、9(9.7 mg)和5(14.9 mg)。Fr.11-1-1通過(guò)半制備HPLC，以70%乙腈為流動(dòng)相，分離得到化合物10(9.3 mg)。Fr.11-1-1以50%乙腈為流動(dòng)相，分離得到化合物8(8.5 mg)。Fr.13-2-1以55%乙腈為流動(dòng)相，分離得到化合物4(34.7 mg)和2(18.9 mg)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance, NMR)和質(zhì)譜(mass spectrum, MS)數(shù)據(jù)，對(duì)比文獻(xiàn)報(bào)道中的波譜數(shù)據(jù)，結(jié)合理化性質(zhì)、酸水解結(jié)果，鑒定了10個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并對(duì)所得化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

2.2 化合物1

化合物1為白色無(wú)定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該化合物可能是皂苷類(lèi)化合物。電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z760 [M + Na]+和737 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C39H62O13。在1H NMR譜(800 MHz, C5D5N)高場(chǎng)區(qū)顯示4個(gè)甲基氫信號(hào)：δH0.85 (s), 1.01 (s), 1.17 (d,J= 6.8 Hz), 0.89 (d,J= 6.0 Hz)，一組三取代烯烴氫信號(hào)δH5.30 (br s)。結(jié)合1H的異核單量子相關(guān)譜(1H detected heteronuclear single quantum coherence, HSQC)，在13C NMR譜中顯示4個(gè)對(duì)應(yīng)甲基碳信號(hào)δC17.1、20.0、9.3和17.3，一組對(duì)應(yīng)的三取代烯烴碳信號(hào)δC141.3和122.8，以及2個(gè)季碳信號(hào)δC38.1和44.9、1個(gè)含氧季碳信號(hào)δC91.8和1個(gè)半縮醛季碳信號(hào)δC111.9。H2-26化學(xué)位移值的差(ΔδH= 3.78-3.43 = 0.35 < 0.48)，可以確定C25為R構(gòu)型[13]，以上數(shù)據(jù)表明化合物1是異螺甾烷醇型甾體皂苷[14]。在1H的異核多健相關(guān)譜(1H detected heteronuclear multiple bond correlation, HMBC)中，δH2.78 (H-4)、1.90 (H-7)與C-5、C-6分別存在遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，表明雙鍵位于5(6)位?；衔?的C-16和C-17信號(hào)分別為δC91.1和91.8，表明化合物1的C-17位連有羥基，按照生源途徑，該羥基應(yīng)為α構(gòu)型[15]。在核歐沃豪斯效應(yīng)譜(nuclear Overhauser effect spectroscopy, NOESY/NOE)中，H3-19β/H-1b (δH4.08)和H-1a (δH0.96)/H-3 (δH3.85)的NOE相關(guān)峰表明3-OH是β構(gòu)型[16]。綜上分析，化合物1的苷元為偏諾皂苷元[17]。苷元部分的13C NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖1 從巴山重樓中分離的化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)

取化合物1 用2 mol/L三氟乙酸水解，按文獻(xiàn)方法[10,18]將所得單糖制備三甲基硅醚化L-半胱氨酸衍生物，以標(biāo)準(zhǔn)糖衍生物作對(duì)照，進(jìn)行GC分析，表明化合物1的單糖組成為D-Glc和L-Rha (1∶1)。在1H NMR譜中顯示2個(gè)糖基的端基氫信號(hào)δH4.95 (d,J= 7.6 Hz, Glc Ⅰ)和6.41 (br s, Rha Ⅰ)。在HSQC譜中可找到各端基氫所對(duì)應(yīng)的端基碳信號(hào)δC100.6和102.3。由葡萄糖端基氫的偶合常數(shù)(J> 7.0 Hz)可知葡萄糖形成的苷鍵為β構(gòu)型；由鼠李糖C-3和C-5化學(xué)位移分別為δC72.5和69.7可知鼠李糖形成的苷鍵為α構(gòu)型[19-20]。在HMBC譜中，Glc Ⅰ C-1與苷元C-3存在遠(yuǎn)程相關(guān)峰，說(shuō)明Glc Ⅰ連接于苷元C-3位；Rha Ⅰ的H-1與Glc Ⅰ的C-4存在遠(yuǎn)程相關(guān)，表明Rha Ⅰ連接于Glc Ⅰ的4位。糖基部分的13C NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2?；衔?的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的重樓皂苷Ⅵ的數(shù)據(jù)一致[21]，從而確定化合物1為偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，即重樓皂苷Ⅵ。

2.3 化合物2

化合物2為白色無(wú)定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該化合物可能是皂苷類(lèi)化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z891 [M + Na]+和867 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C45H72O16?；衔?苷元部分的碳譜信號(hào)與化合物1的信號(hào)基本一致，不同之處在于化合物2苷元部分的C-16和C-17信號(hào)分別向高場(chǎng)位移至δC81.9和62.4，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)[22]，確定化合物2的苷元為薯蕷皂苷元。將化合物2按照與化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過(guò)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha (1∶1)。通過(guò)二維核磁共振波譜(Two Dimension Nuclear Magnetic Resonance, 2D NMR)分析歸屬了化合物2的所有碳?xì)湫盘?hào)，化合物2的碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2，重要的1H NMR(800 MHz, C5D5N)信號(hào)如下：δH0.93 (s, H3-18), 1.13 (s, H3-19), 1.32 (d,J= 5.4 Hz, H3-21), 0.95 (d,J= 7.3 Hz, H3-27), 5.30 (br s, H-6), δH4.96 (d,J= 8.3 Hz, Glc Ⅰ H-1), 6.42 (br s, Rha Ⅰ H-1)和6.32 (br s, Rha Ⅱ H-1)?；衔?的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物一致[23]，從而確定化合物2為薯蕷皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.4 化合物3

化合物3為白色無(wú)定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該化合物可能是皂苷類(lèi)化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z779 [M + Na]+和755 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C39H64O14?；衔?苷元部分的碳譜信號(hào)與化合物2的信號(hào)基本一致，不同之處在于化合物3苷元部分少了一對(duì)烯烴信號(hào)(δC142.0和121.8)，而多了一個(gè)含氧季碳(δC75.5)和一個(gè)含氧叔碳信號(hào)(δH4.90, δC75.4)。在氫-氫化學(xué)位移相關(guān)譜(1H-1H correlation spectroscopy,1H-1H COSY)中，可以觀察到H-6 (δH4.92, m)/H2-7 (δH2.16, 1.92)/H-8 (δH2.33)/H-9 (δH1.90)的相關(guān)信號(hào)，以及HMBC譜中H3-19 (δH1.66, s)、H-4β (δH2.95, t,J= 12.1 Hz)和H-6 (δH4.92, m)與C-5 (δC75.5)的相關(guān)峰，可以推測(cè)羥基位于C-5和C-6位。在NOESY譜中，H3-19 (δH1.66, s)與H-2β (δH2.14)/H-4β (δH2.95, t,J= 12.5 Hz)之間的相關(guān)信號(hào)表明A/B環(huán)是反式連接，5-OH是α構(gòu)型；H-6 (δH4.92, m) 和H-4α (δH2.44, dd,J= 13.2, 5.2 Hz)的NOE相關(guān)表明6-OH是β構(gòu)型[22]?；衔?通過(guò)酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha，組成比為1∶1。在1HNMR譜中顯示2個(gè)糖基的端基氫信號(hào)δH4.95 (d,J= 7.3 Hz, Glc Ⅰ)和6.30 (br s, Rha Ⅰ)，HSQC譜中顯示對(duì)應(yīng)的端基碳信號(hào)δC100.5和102.9。通過(guò)一維核磁共振譜(One Dimension Nuclear Magnetic Resonance, 1D NMR)和2D NMR譜將該化合物碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行歸屬，碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2，波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物一致[22]，從而確定化合物3為3β,5α,6β-三羥基-(25R)-螺甾-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.5 化合物4

化合物4為白色無(wú)定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該化合物可能是皂苷類(lèi)化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z923 [M + Na]+和899 [M-H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C45H72O18?；衔?苷元部分的碳譜信號(hào)與化合物2的信號(hào)基本一致，不同之處在于化合物4苷元部分少了兩個(gè)亞甲基信號(hào)(δC35.9, 41.5)，多了兩個(gè)次甲基信號(hào)(δH4.02, 3.51; δC72.3, 55.8)，C-7和C-12分別向低場(chǎng)位移了ΔδC+36.4和 +14.3，表明C-7和C-12位連有羥基。在NOESY譜中，H-1α (δH0.98)與H-6 (δH5.65)、H-6 (δH5.65)與H-9 (δH1.24)/H-7 ( 4.05)以及H-7 (δH4.05)與H-9 (δH1.24)的NOE相關(guān)表明7-OH為β構(gòu)型；H-12 (δH3.58)與H-14 (δH1.45), H-14 (δH1.45)與H-17 (δH2.20), H-16 (δH4.68)與H-17 (δH2.20)以及H3-18 (δH1.15)與H-8 (δH1.85)/H-20 (δH2.17)的NOE相關(guān)，表明12-OH為β構(gòu)型[24]?；衔?通過(guò)酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha，組成比為1∶2。通過(guò)2D NMR分析歸屬了化合物4的所有碳?xì)湫盘?hào)，碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz，C5D5N)信號(hào)如下：δH1.15 (s, H3-18), 1.24 (s, H3-19), 1.42 (d,J= 6.3 Hz, H3-21), 0.71 (d,J= 5.7 Hz, H3-27), 5.68 (br s, H-6), δH4.95 (d,J= 7.5 Hz, Glc Ⅰ H-1), 5.72 (br s, Rha Ⅰ H-1)和6.27 (br s,J= 1.7 Hz, Rha Ⅱ H-1)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[24]，從而確定化合物4為3β,7β,12β-三羥基-(25R)-螺甾-5-烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.6 化合物5

化合物5為白色無(wú)定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該化合物可能是皂苷類(lèi)化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z939 [M + Na]+和915 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C46H76O18。在1H NMR中可看到4個(gè)甲基氫信號(hào)0.82 (s), 1.05 (s), 1.14 (d,J= 5.8 Hz)和0.68 (s)，一個(gè)烯烴質(zhì)子信號(hào)δH5.33 (br s)，在HSQC譜中可以觀察到對(duì)應(yīng)的4個(gè)甲基碳信號(hào)δC17.6, 19.5, 16.2和18.5，一對(duì)烯烴碳信號(hào)δC142.0和121.8，以及13C NMR中一個(gè)含氧季碳信號(hào)δC79.6和一個(gè)半縮醛季碳信號(hào)δC110.5，以上數(shù)據(jù)與Zhao等[17]從云南重樓中得到的parisyunnanoside A的苷元數(shù)據(jù)基本一致，據(jù)此推測(cè)化合物5的苷元具有呋甾烷醇的骨架。在HMBC譜中，1H NMR中的1個(gè)甲氧基信號(hào)δH5.35 (br s)與C-22有遠(yuǎn)程相關(guān)，且C-21的化學(xué)位移值是δC110.5(而不是δC115.5)，表示β-OCH3位于C-22位[25]。將化合物5按照化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過(guò)GC分析確定其單糖組成為D-Glc和L-Rha (2∶1)。NMR譜中顯示3個(gè)糖的端基氫信號(hào)和碳信號(hào)δH4.92 (d,J= 7.7 Hz, Glc Ⅰ), 6.27 (br s, Rha Ⅰ)和5.07 (d,J= 7.0 Hz, Glc Ⅱ)以及δC101.2 (Glc Ⅰ), 103.3 (Rha Ⅰ)和105.7 (Glc Ⅱ)。由HMBC譜中的遠(yuǎn)程相關(guān)峰可以確定化合物5結(jié)構(gòu)中糖的連接順序。化合物5苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2。通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物的波譜數(shù)據(jù)比較[26]，基本一致，從而確定化合物5的結(jié)構(gòu)為22-甲氧基-3β,26-二羥基-(25R)-呋甾-5-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-α-L-吡喃葡萄糖苷，即icogenin 1。

2.7 化合物6

化合物6為白色無(wú)定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該化合物可能是皂苷類(lèi)化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 1231 [M + Na]+和1207 [M- H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C58H96O26?；衔?苷元的波譜數(shù)據(jù)與化合物5的基本一致，區(qū)別在于C-26向低場(chǎng)位移了ΔδC+8.1，表明C-26位可能連有糖基。化合物6的三甲基硅醚化L-半胱氨酸衍生物經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha，組成比為2∶3。通過(guò)2D NMR分析歸屬了化合物6的所有碳?xì)湫盘?hào)，苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz，C5D5N)信號(hào)如下：δH0.86 (s, H3-18), 1.07 (s, H3-19), 1.02 (d,J= 6.5 Hz, H3-21), 0.98 (d,J= 6.0 Hz, H3-27), 5.40 (br s, H-6), 4.55 (d,J= 7.6 Hz, Glc Ⅰ H-1), 4.20 (d,J= 7.8 Hz, Glc Ⅱ H-1), 5.20 (br s, Rha Ⅰ H-1), 4.86 (br s, Rha Ⅱ H-1)和5.27 (br s, Rha Ⅲ H-1)?；衔?的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中化合物對(duì)比基本一致[27]，從而確定化合物6為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-3β,26-二羥基-(25R)-呋甾-5-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖苷。

2.8 化合物7

化合物7為白色無(wú)定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該化合物可能是皂苷類(lèi)化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z987 [M+Na]+和963 [M-H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C47H80O20?；衔?與化合物6苷元部分的波譜數(shù)據(jù)基本一致，區(qū)別在于化合物7的C-2向低場(chǎng)位移至δC69.8，表明C-2位連有羥基?；衔?的酸水解單糖衍生物經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和D-Gal (2∶1)。通過(guò)2D NMR分析歸屬了化合物7的所有碳?xì)湫盘?hào)，苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz, C5D5N)信號(hào)如下：δH0.89 (s, H3-18), 0.95 (s, H3-19), 1.35(d,J=7.4 Hz, H3-21), 0.90 (d,J=6.2 Hz, H3-27), 5.37 (br s, H-6), 4.84 (d,J=7.3 Hz, Glc Ⅰ H-1), 4.78 (d,J=7.8 Hz, Glc Ⅱ H-1)和4.85 (d,J=8.0 Hz, Gal Ⅰ H-1)。由Gal的端基氫的偶合常數(shù)(J> 7.0 Hz)確定其形成的苷鍵為β構(gòu)型[28]。與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物cesdiurin Ⅱ的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照[29]，基本一致，從而確定化合物7的結(jié)構(gòu)為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-3β,2,26-三羥基-(25R)-呋甾-5-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，即cesdiurin Ⅱ。

2.9 化合物8

化合物8為白色無(wú)定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該化合物可能是皂苷類(lèi)化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1231 [M + Na]+和1207 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C57H92O27。在1H NMR譜中可看到4個(gè)甲基氫信號(hào)δH0.73 (s, H3-18), 1.05 (s, H3-19), 1.62(s, H3-21), 1.02 (d,J= 6.2 Hz, H3-27)和1個(gè)烯烴質(zhì)子信號(hào)δH5.46 (s, H-6)。13C NMR譜中的兩對(duì)烯烴碳信號(hào)δC141.3和122.1；δC104.1和153.3。通過(guò)與huangjiangsu A[30]和ceparoside C[31]的波譜數(shù)據(jù)比較，表明兩個(gè)雙鍵分別位于Δ5(6)和Δ20(21)?；衔?酸水解的單糖衍生物經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha (4∶1)。1H NMR譜中顯示5個(gè)糖的端基氫信號(hào)δH4.96 (d,J= 7.3 Hz, Glc Ⅰ H-1), 5.14 (d,J= 7.5 Hz, Glc Ⅱ H-1), 5.25 (d,J= 7.8 Hz, Glc Ⅲ H-1), 4.85 (d,J= 7.0 Hz, Glc Ⅳ H-1), 6.27 (br s, Rha Ⅰ H-1)。通過(guò)2D NMR分析歸屬了化合物8的所有碳?xì)湫盘?hào)，苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2。對(duì)照發(fā)現(xiàn)化合物8與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物波譜數(shù)據(jù)基本一致[32]，從而確定化合物8的結(jié)構(gòu)為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β,26-二羥基-(25R)-呋甾-5,20(22)-二烯-3-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)]-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，即zingiberenoside B。

2.10 化合物9

化合物9為白色無(wú)定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該化合物可能是皂苷類(lèi)化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1083 [M + Na]+和1059 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C52H84O22。通過(guò)2D NMR分析歸屬了化合物9的所有碳?xì)湫盘?hào)，苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz, C5D5N)信號(hào)如下：δH1.06 (s, H3-18), 0.72 (s, H3-19), 1.76 (d,J=6.0 Hz, H3-21), 1.16 (d,J= 6.5Hz, H3-27), 5.30 (br s, H-6), 4.95 (d,J= 7.0 Hz, Glc Ⅰ H-1), 4.85 (d,J= 7.5 Hz, Glc Ⅱ H-1), 5.92 (br s, Rha Ⅰ H-1)和6.43 (br s, Rha Ⅱ H-1)。化合物9的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物波譜數(shù)據(jù)基本一致[33]，從而確定化合物9為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-15α-甲氧基-3β,26-二羥基-(25R)-呋甾-5,20-二烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.11 化合物10

化合物10為白色無(wú)定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該化合物可能是皂苷類(lèi)化合物。ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1083 [M + Na]+和1059 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C52H84O22。在1H NMR (800 MHz, C5D5N)譜的高場(chǎng)區(qū)中顯示4個(gè)甲基氫信號(hào)δH0.88 (s), 1.06 (s), 1.42 (d,J= 7.2 Hz)和1.10 (br d,J= 6.3 Hz)，4個(gè)糖的端基氫信號(hào)4.97 (d,J= 7.0 Hz), 4.90 (d,J= 7.5 Hz,), 6.42 (br s)和5.88 (br s)。結(jié)合HSQC譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)甲基氫信號(hào)分別與δC13.9, 19.8, 15.6和17.90信號(hào)相關(guān)，4個(gè)端基氫信號(hào)分別與δC100.6, 105.3, 102.4和103.2相關(guān)?；衔?0的13C NMR譜中顯示1個(gè)甲氧基信號(hào)(δC49.2)，2個(gè)三取代雙鍵信號(hào)(δC122.1和141.1; δC157.5和96.6)?；衔?0酸水解的單糖衍生物經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha (2∶2)。通過(guò)2D NMR分析歸屬了化合物10的所有碳?xì)湫盘?hào)，苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2。將化合物10的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照[34]，從而確定其結(jié)構(gòu)為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20-甲氧基-3β,26-二羥基-(25R)-呋甾-5,22-二烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，即dioscoreside E。

表1 從巴山重樓中分離的化合物1-10苷元部分的13C NMR數(shù)據(jù) (200 MHz, C5D5N)

表2 從巴山重樓中分離到的化合物1-10糖基部分的13C NMR數(shù)據(jù) (200 MHz, C5D5N)

續(xù)表

3 討論

近年來(lái)，對(duì)重樓屬植物化學(xué)成分和藥理作用的研究越來(lái)越多，但主要集中在云南重樓和七葉一枝花兩個(gè)藥典品種上，而隨著藥典重樓市場(chǎng)需求的逐年增加，野生重樓資源日益枯竭，在加大人工種植的同時(shí)，尋找新的重樓替代資源成為了緩解資源危機(jī)的關(guān)鍵[35-36]。巴山重樓作為重樓屬植物中重要的一員，其在土家族中廣泛應(yīng)用，但對(duì)其化學(xué)成分的研究不夠充分，僅從中分離鑒定了19個(gè)甾體皂苷。本研究在本課題組前期提取分離的基礎(chǔ)上，對(duì)巴山重樓70%乙醇提取物的正丁醇萃取部分進(jìn)行了深入的研究，從中分離鑒定了10個(gè)甾體皂苷，除化合物1外，均首次從該種植物中分離得到，豐富了巴山重樓中甾體皂苷類(lèi)成分的多樣性。本研究為該植物的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供了化學(xué)成分基礎(chǔ)，后續(xù)將開(kāi)展該植物藥理活性方面的研究，為其資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供充足的科學(xué)依據(jù)。