田韻遠 樊培 陸云陽 劉楊 陳文文 胡晉銘 曹宇 袁曉峰 李天怡 湯海峰

中藥重樓為百合科(Liliaceae)重樓屬植物云南重樓[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.]和七葉一枝花[P.polyphyllaSmithvar.chenensis(Franch.) Hara]的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛和涼肝定驚的功效[1]。云南白藥、熱毒清片和宮血寧膠囊等多種中成藥的主要藥材均為重樓。對重樓屬植物化學成分的研究始于60年代初，黃偉光等[2]從云南重樓中分離得到薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元。近年來，對中藥重樓化學成分和藥理作用的研究報道越來越多，研究表明重樓的主要藥效成分是甾體皂苷，亦總稱為重樓皂苷，具有抗腫瘤、抗菌、抗心肌缺血、抗氧化等多方面的生物活性[3-5]。重樓的藥用價值被不斷發(fā)掘，基源植物被大量采摘，且該植物生長周期長、自然更替緩慢，使得其自然資源嚴重緊缺，出現(xiàn)了供不應求的現(xiàn)象，價格連年攀升[6-7]。在廣泛開展重樓人工培育的同時，從民族民間藥特別是重樓屬其他植物中尋找新的替代資源是解決其資源匱乏的重要途徑。

巴山重樓(Parisbashanensis)主要分布于湖北、重慶和四川等地，經(jīng)作者考察，在陜南亦有分布。巴山重樓的根莖是土家族的常用藥材，被稱為“露水珠”，具有散寒祛濕、通絡(luò)止痛和止血生津的功效，主要用于頭痛、痢疾和毒蟲咬傷等疾病的治療[8-9]。目前，包括本課題組的研究工作在內(nèi)[10]，僅報道從巴山重樓中分離鑒定了19個化合物[11-12]，對其化學成分的研究不夠充分，有待進一步闡明其所含化學成分。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，繼續(xù)報道對巴山重樓根莖中甾體皂苷類化學成分的研究工作，進一步開展其皂苷類成分的研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Quatrro Micro質(zhì)譜儀(Micromass公司)；Bruker AVANCE 800型核磁共振波譜儀(Bruker公司)；戴安P680高效液相色譜儀(P680系列單泵、UV-VS 檢測器、CHROMELON工作站)[配YMC-Pack R&D ODS-A半制備色譜柱(20 mm × 250 mm，5 μm)]；Agilent GC-6820氣相色譜儀[配HP-5彈性石英毛細管柱(30 m × 0.32 mm，0.25 μm)，氫火焰離子化檢測器]；ODS C18柱(Pharmacia公司)；Sephadex LH-20凝膠(GE公司)；柱色譜硅膠(100～200目、200～300目)、薄層色譜用硅膠H、預制硅膠板G(青島海洋化工廠)；RP-18高效薄層預制板(Merck公司)。色譜純甲醇(天津科密歐公司)；氘代試劑(Merck公司)；標準品D-葡萄糖(D-glucose, D-Glc)、L-鼠李糖(L-rhamnose, L-Rha)和D-半乳糖(D-galactose, D-Gal)(Sigma公司，純度≥ 99%)；顯色劑(10%硫酸/乙醇溶液)；其他試劑均為分析純。

藥材于2018年9月采自陜西省安康市鎮(zhèn)坪縣，經(jīng)空軍軍醫(yī)大學藥學系中藥與天然藥物學教研室湯海峰教授鑒定為巴山重樓(ParisbashanensisWang et Tang)的根莖，藥材標本(編號：20189013)保存在空軍軍醫(yī)大學藥學系中藥與天然藥物學教研室標本室。

1.2 化學成分的提取與分離

干燥的巴山重樓根莖0.8 kg，用70%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取5次，每次2小時，減壓回收溶劑得醇提浸膏210 g。將浸膏加適量水分散，用等體積石油醚萃取5次，再用等體積水飽和正丁醇萃取6次，合并回收正丁醇層得到總皂苷160 g。所得總皂苷經(jīng)硅膠柱色譜，用V二氯甲烷∶V甲醇∶V水(80∶1∶0 ～ 65∶35∶10)為洗脫劑梯度洗脫，合并得到25個組分(Fr.1 ～ Fr.25)。根據(jù)薄層色譜展開情況，選取Fr.6、Fr.8、Fr.11、Fr.12和Fr.13分別經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(洗脫劑為甲醇)除去水溶性雜質(zhì)后，再經(jīng)反相硅膠柱色譜，以V甲醇∶V水(80∶20 ～ 40∶60, v/v)梯度洗脫，得到Fr.6-2-1、Fr.8-3-2、Fr.11-1-1、Fr.12-1-1和Fr.13-2-1。Fr.6-2-1以60%乙腈為流動相，通過半制備高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)；流速10 mL/min，檢測波長206 nm(以下色譜條件均相同)，分離得到化合物3(9.5 mg)、7(7.9 mg)和Fr.6-2-1-2，F(xiàn)r.6-2-1-2以50%乙腈為流動相，通過半制備HPLC純化得到化合物1(16.9 mg)。Fr.8-3-2以55%乙腈為流動相，通過半制備HPLC純化得到化合物6(35 mg)、9(9.7 mg)和5(14.9 mg)。Fr.11-1-1通過半制備HPLC，以70%乙腈為流動相，分離得到化合物10(9.3 mg)。Fr.11-1-1以50%乙腈為流動相，分離得到化合物8(8.5 mg)。Fr.13-2-1以55%乙腈為流動相，分離得到化合物4(34.7 mg)和2(18.9 mg)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance, NMR)和質(zhì)譜(mass spectrum, MS)數(shù)據(jù)，對比文獻報道中的波譜數(shù)據(jù)，結(jié)合理化性質(zhì)、酸水解結(jié)果，鑒定了10個化合物的化學結(jié)構(gòu)，并對所得化合物進行結(jié)構(gòu)解析。

2.2 化合物1

化合物1為白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)顯示其準分子離子峰為m/z760 [M + Na]+和737 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C39H62O13。在1H NMR譜(800 MHz, C5D5N)高場區(qū)顯示4個甲基氫信號：δH0.85 (s), 1.01 (s), 1.17 (d,J= 6.8 Hz), 0.89 (d,J= 6.0 Hz)，一組三取代烯烴氫信號δH5.30 (br s)。結(jié)合1H的異核單量子相關(guān)譜(1H detected heteronuclear single quantum coherence, HSQC)，在13C NMR譜中顯示4個對應甲基碳信號δC17.1、20.0、9.3和17.3，一組對應的三取代烯烴碳信號δC141.3和122.8，以及2個季碳信號δC38.1和44.9、1個含氧季碳信號δC91.8和1個半縮醛季碳信號δC111.9。H2-26化學位移值的差(ΔδH= 3.78-3.43 = 0.35 < 0.48)，可以確定C25為R構(gòu)型[13]，以上數(shù)據(jù)表明化合物1是異螺甾烷醇型甾體皂苷[14]。在1H的異核多健相關(guān)譜(1H detected heteronuclear multiple bond correlation, HMBC)中，δH2.78 (H-4)、1.90 (H-7)與C-5、C-6分別存在遠程相關(guān)信號，表明雙鍵位于5(6)位?；衔?的C-16和C-17信號分別為δC91.1和91.8，表明化合物1的C-17位連有羥基，按照生源途徑，該羥基應為α構(gòu)型[15]。在核歐沃豪斯效應譜(nuclear Overhauser effect spectroscopy, NOESY/NOE)中，H3-19β/H-1b (δH4.08)和H-1a (δH0.96)/H-3 (δH3.85)的NOE相關(guān)峰表明3-OH是β構(gòu)型[16]。綜上分析，化合物1的苷元為偏諾皂苷元[17]。苷元部分的13C NMR數(shù)據(jù)見表1。

圖1 從巴山重樓中分離的化合物1～10的化學結(jié)構(gòu)

取化合物1 用2 mol/L三氟乙酸水解，按文獻方法[10,18]將所得單糖制備三甲基硅醚化L-半胱氨酸衍生物，以標準糖衍生物作對照，進行GC分析，表明化合物1的單糖組成為D-Glc和L-Rha (1∶1)。在1H NMR譜中顯示2個糖基的端基氫信號δH4.95 (d,J= 7.6 Hz, Glc Ⅰ)和6.41 (br s, Rha Ⅰ)。在HSQC譜中可找到各端基氫所對應的端基碳信號δC100.6和102.3。由葡萄糖端基氫的偶合常數(shù)(J> 7.0 Hz)可知葡萄糖形成的苷鍵為β構(gòu)型；由鼠李糖C-3和C-5化學位移分別為δC72.5和69.7可知鼠李糖形成的苷鍵為α構(gòu)型[19-20]。在HMBC譜中，Glc Ⅰ C-1與苷元C-3存在遠程相關(guān)峰，說明Glc Ⅰ連接于苷元C-3位；Rha Ⅰ的H-1與Glc Ⅰ的C-4存在遠程相關(guān)，表明Rha Ⅰ連接于Glc Ⅰ的4位。糖基部分的13C NMR數(shù)據(jù)見表2。化合物1的波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的重樓皂苷Ⅵ的數(shù)據(jù)一致[21]，從而確定化合物1為偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，即重樓皂苷Ⅵ。

2.3 化合物2

化合物2為白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰為m/z891 [M + Na]+和867 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C45H72O16?；衔?苷元部分的碳譜信號與化合物1的信號基本一致，不同之處在于化合物2苷元部分的C-16和C-17信號分別向高場位移至δC81.9和62.4，結(jié)合文獻報道的波譜數(shù)據(jù)[22]，確定化合物2的苷元為薯蕷皂苷元。將化合物2按照與化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha (1∶1)。通過二維核磁共振波譜(Two Dimension Nuclear Magnetic Resonance, 2D NMR)分析歸屬了化合物2的所有碳氫信號，化合物2的碳譜數(shù)據(jù)見表1和表2，重要的1H NMR(800 MHz, C5D5N)信號如下：δH0.93 (s, H3-18), 1.13 (s, H3-19), 1.32 (d,J= 5.4 Hz, H3-21), 0.95 (d,J= 7.3 Hz, H3-27), 5.30 (br s, H-6), δH4.96 (d,J= 8.3 Hz, Glc Ⅰ H-1), 6.42 (br s, Rha Ⅰ H-1)和6.32 (br s, Rha Ⅱ H-1)?；衔?的波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的化合物一致[23]，從而確定化合物2為薯蕷皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.4 化合物3

化合物3為白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰為m/z779 [M + Na]+和755 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C39H64O14?；衔?苷元部分的碳譜信號與化合物2的信號基本一致，不同之處在于化合物3苷元部分少了一對烯烴信號(δC142.0和121.8)，而多了一個含氧季碳(δC75.5)和一個含氧叔碳信號(δH4.90, δC75.4)。在氫-氫化學位移相關(guān)譜(1H-1H correlation spectroscopy,1H-1H COSY)中，可以觀察到H-6 (δH4.92, m)/H2-7 (δH2.16, 1.92)/H-8 (δH2.33)/H-9 (δH1.90)的相關(guān)信號，以及HMBC譜中H3-19 (δH1.66, s)、H-4β (δH2.95, t,J= 12.1 Hz)和H-6 (δH4.92, m)與C-5 (δC75.5)的相關(guān)峰，可以推測羥基位于C-5和C-6位。在NOESY譜中，H3-19 (δH1.66, s)與H-2β (δH2.14)/H-4β (δH2.95, t,J= 12.5 Hz)之間的相關(guān)信號表明A/B環(huán)是反式連接，5-OH是α構(gòu)型；H-6 (δH4.92, m) 和H-4α (δH2.44, dd,J= 13.2, 5.2 Hz)的NOE相關(guān)表明6-OH是β構(gòu)型[22]。化合物3通過酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha，組成比為1∶1。在1HNMR譜中顯示2個糖基的端基氫信號δH4.95 (d,J= 7.3 Hz, Glc Ⅰ)和6.30 (br s, Rha Ⅰ)，HSQC譜中顯示對應的端基碳信號δC100.5和102.9。通過一維核磁共振譜(One Dimension Nuclear Magnetic Resonance, 1D NMR)和2D NMR譜將該化合物碳氫信號進行歸屬，碳譜數(shù)據(jù)見表1和表2，波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的化合物一致[22]，從而確定化合物3為3β,5α,6β-三羥基-(25R)-螺甾-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.5 化合物4

化合物4為白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰為m/z923 [M + Na]+和899 [M-H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C45H72O18?；衔?苷元部分的碳譜信號與化合物2的信號基本一致，不同之處在于化合物4苷元部分少了兩個亞甲基信號(δC35.9, 41.5)，多了兩個次甲基信號(δH4.02, 3.51; δC72.3, 55.8)，C-7和C-12分別向低場位移了ΔδC+36.4和 +14.3，表明C-7和C-12位連有羥基。在NOESY譜中，H-1α (δH0.98)與H-6 (δH5.65)、H-6 (δH5.65)與H-9 (δH1.24)/H-7 ( 4.05)以及H-7 (δH4.05)與H-9 (δH1.24)的NOE相關(guān)表明7-OH為β構(gòu)型；H-12 (δH3.58)與H-14 (δH1.45), H-14 (δH1.45)與H-17 (δH2.20), H-16 (δH4.68)與H-17 (δH2.20)以及H3-18 (δH1.15)與H-8 (δH1.85)/H-20 (δH2.17)的NOE相關(guān)，表明12-OH為β構(gòu)型[24]。化合物4通過酸水解及衍生，經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha，組成比為1∶2。通過2D NMR分析歸屬了化合物4的所有碳氫信號，碳譜數(shù)據(jù)見表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz，C5D5N)信號如下：δH1.15 (s, H3-18), 1.24 (s, H3-19), 1.42 (d,J= 6.3 Hz, H3-21), 0.71 (d,J= 5.7 Hz, H3-27), 5.68 (br s, H-6), δH4.95 (d,J= 7.5 Hz, Glc Ⅰ H-1), 5.72 (br s, Rha Ⅰ H-1)和6.27 (br s,J= 1.7 Hz, Rha Ⅱ H-1)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的化合物基本一致[24]，從而確定化合物4為3β,7β,12β-三羥基-(25R)-螺甾-5-烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.6 化合物5

化合物5為白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰為m/z939 [M + Na]+和915 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C46H76O18。在1H NMR中可看到4個甲基氫信號0.82 (s), 1.05 (s), 1.14 (d,J= 5.8 Hz)和0.68 (s)，一個烯烴質(zhì)子信號δH5.33 (br s)，在HSQC譜中可以觀察到對應的4個甲基碳信號δC17.6, 19.5, 16.2和18.5，一對烯烴碳信號δC142.0和121.8，以及13C NMR中一個含氧季碳信號δC79.6和一個半縮醛季碳信號δC110.5，以上數(shù)據(jù)與Zhao等[17]從云南重樓中得到的parisyunnanoside A的苷元數(shù)據(jù)基本一致，據(jù)此推測化合物5的苷元具有呋甾烷醇的骨架。在HMBC譜中，1H NMR中的1個甲氧基信號δH5.35 (br s)與C-22有遠程相關(guān)，且C-21的化學位移值是δC110.5(而不是δC115.5)，表示β-OCH3位于C-22位[25]。將化合物5按照化合物1相同的方法酸水解后制備成單糖衍生物，通過GC分析確定其單糖組成為D-Glc和L-Rha (2∶1)。NMR譜中顯示3個糖的端基氫信號和碳信號δH4.92 (d,J= 7.7 Hz, Glc Ⅰ), 6.27 (br s, Rha Ⅰ)和5.07 (d,J= 7.0 Hz, Glc Ⅱ)以及δC101.2 (Glc Ⅰ), 103.3 (Rha Ⅰ)和105.7 (Glc Ⅱ)。由HMBC譜中的遠程相關(guān)峰可以確定化合物5結(jié)構(gòu)中糖的連接順序。化合物5苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見表1和表2。通過與文獻報道的化合物的波譜數(shù)據(jù)比較[26]，基本一致，從而確定化合物5的結(jié)構(gòu)為22-甲氧基-3β,26-二羥基-(25R)-呋甾-5-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-α-L-吡喃葡萄糖苷，即icogenin 1。

2.7 化合物6

化合物6為白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰為m/z 1231 [M + Na]+和1207 [M- H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C58H96O26?；衔?苷元的波譜數(shù)據(jù)與化合物5的基本一致，區(qū)別在于C-26向低場位移了ΔδC+8.1，表明C-26位可能連有糖基?；衔?的三甲基硅醚化L-半胱氨酸衍生物經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha，組成比為2∶3。通過2D NMR分析歸屬了化合物6的所有碳氫信號，苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz，C5D5N)信號如下：δH0.86 (s, H3-18), 1.07 (s, H3-19), 1.02 (d,J= 6.5 Hz, H3-21), 0.98 (d,J= 6.0 Hz, H3-27), 5.40 (br s, H-6), 4.55 (d,J= 7.6 Hz, Glc Ⅰ H-1), 4.20 (d,J= 7.8 Hz, Glc Ⅱ H-1), 5.20 (br s, Rha Ⅰ H-1), 4.86 (br s, Rha Ⅱ H-1)和5.27 (br s, Rha Ⅲ H-1)?；衔?的波譜數(shù)據(jù)與文獻中化合物對比基本一致[27]，從而確定化合物6為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-3β,26-二羥基-(25R)-呋甾-5-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖苷。

2.8 化合物7

化合物7為白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰為m/z987 [M+Na]+和963 [M-H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C47H80O20?；衔?與化合物6苷元部分的波譜數(shù)據(jù)基本一致，區(qū)別在于化合物7的C-2向低場位移至δC69.8，表明C-2位連有羥基?；衔?的酸水解單糖衍生物經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和D-Gal (2∶1)。通過2D NMR分析歸屬了化合物7的所有碳氫信號，苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz, C5D5N)信號如下：δH0.89 (s, H3-18), 0.95 (s, H3-19), 1.35(d,J=7.4 Hz, H3-21), 0.90 (d,J=6.2 Hz, H3-27), 5.37 (br s, H-6), 4.84 (d,J=7.3 Hz, Glc Ⅰ H-1), 4.78 (d,J=7.8 Hz, Glc Ⅱ H-1)和4.85 (d,J=8.0 Hz, Gal Ⅰ H-1)。由Gal的端基氫的偶合常數(shù)(J> 7.0 Hz)確定其形成的苷鍵為β構(gòu)型[28]。與文獻報道的化合物cesdiurin Ⅱ的波譜數(shù)據(jù)進行對照[29]，基本一致，從而確定化合物7的結(jié)構(gòu)為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-3β,2,26-三羥基-(25R)-呋甾-5-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，即cesdiurin Ⅱ。

2.9 化合物8

化合物8為白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰為m/z1231 [M + Na]+和1207 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C57H92O27。在1H NMR譜中可看到4個甲基氫信號δH0.73 (s, H3-18), 1.05 (s, H3-19), 1.62(s, H3-21), 1.02 (d,J= 6.2 Hz, H3-27)和1個烯烴質(zhì)子信號δH5.46 (s, H-6)。13C NMR譜中的兩對烯烴碳信號δC141.3和122.1；δC104.1和153.3。通過與huangjiangsu A[30]和ceparoside C[31]的波譜數(shù)據(jù)比較，表明兩個雙鍵分別位于Δ5(6)和Δ20(21)。化合物8酸水解的單糖衍生物經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha (4∶1)。1H NMR譜中顯示5個糖的端基氫信號δH4.96 (d,J= 7.3 Hz, Glc Ⅰ H-1), 5.14 (d,J= 7.5 Hz, Glc Ⅱ H-1), 5.25 (d,J= 7.8 Hz, Glc Ⅲ H-1), 4.85 (d,J= 7.0 Hz, Glc Ⅳ H-1), 6.27 (br s, Rha Ⅰ H-1)。通過2D NMR分析歸屬了化合物8的所有碳氫信號，苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見表1和表2。對照發(fā)現(xiàn)化合物8與文獻報道的化合物波譜數(shù)據(jù)基本一致[32]，從而確定化合物8的結(jié)構(gòu)為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β,26-二羥基-(25R)-呋甾-5,20(22)-二烯-3-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)]-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，即zingiberenoside B。

2.10 化合物9

化合物9為白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰為m/z1083 [M + Na]+和1059 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C52H84O22。通過2D NMR分析歸屬了化合物9的所有碳氫信號，苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz, C5D5N)信號如下：δH1.06 (s, H3-18), 0.72 (s, H3-19), 1.76 (d,J=6.0 Hz, H3-21), 1.16 (d,J= 6.5Hz, H3-27), 5.30 (br s, H-6), 4.95 (d,J= 7.0 Hz, Glc Ⅰ H-1), 4.85 (d,J= 7.5 Hz, Glc Ⅱ H-1), 5.92 (br s, Rha Ⅰ H-1)和6.43 (br s, Rha Ⅱ H-1)?；衔?的NMR數(shù)據(jù)與文獻報道的化合物波譜數(shù)據(jù)基本一致[33]，從而確定化合物9為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-15α-甲氧基-3β,26-二羥基-(25R)-呋甾-5,20-二烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.11 化合物10

化合物10為白色無定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反應呈陽性，表明該化合物可能是皂苷類化合物。ESI-MS顯示其準分子離子峰為m/z1083 [M + Na]+和1059 [M - H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜(200 MHz, C5D5N)數(shù)據(jù)推斷其分子式為C52H84O22。在1H NMR (800 MHz, C5D5N)譜的高場區(qū)中顯示4個甲基氫信號δH0.88 (s), 1.06 (s), 1.42 (d,J= 7.2 Hz)和1.10 (br d,J= 6.3 Hz)，4個糖的端基氫信號4.97 (d,J= 7.0 Hz), 4.90 (d,J= 7.5 Hz,), 6.42 (br s)和5.88 (br s)。結(jié)合HSQC譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)4個甲基氫信號分別與δC13.9, 19.8, 15.6和17.90信號相關(guān)，4個端基氫信號分別與δC100.6, 105.3, 102.4和103.2相關(guān)?；衔?0的13C NMR譜中顯示1個甲氧基信號(δC49.2)，2個三取代雙鍵信號(δC122.1和141.1; δC157.5和96.6)?；衔?0酸水解的單糖衍生物經(jīng)GC分析表明其糖基為D-Glc和L-Rha (2∶2)。通過2D NMR分析歸屬了化合物10的所有碳氫信號，苷元和糖基的碳譜數(shù)據(jù)見表1和表2。將化合物10的波譜數(shù)據(jù)與文獻對照[34]，從而確定其結(jié)構(gòu)為26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20-甲氧基-3β,26-二羥基-(25R)-呋甾-5,22-二烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，即dioscoreside E。

表1 從巴山重樓中分離的化合物1-10苷元部分的13C NMR數(shù)據(jù) (200 MHz, C5D5N)

表2 從巴山重樓中分離到的化合物1-10糖基部分的13C NMR數(shù)據(jù) (200 MHz, C5D5N)

續(xù)表

3 討論

近年來，對重樓屬植物化學成分和藥理作用的研究越來越多，但主要集中在云南重樓和七葉一枝花兩個藥典品種上，而隨著藥典重樓市場需求的逐年增加，野生重樓資源日益枯竭，在加大人工種植的同時，尋找新的重樓替代資源成為了緩解資源危機的關(guān)鍵[35-36]。巴山重樓作為重樓屬植物中重要的一員，其在土家族中廣泛應用，但對其化學成分的研究不夠充分，僅從中分離鑒定了19個甾體皂苷。本研究在本課題組前期提取分離的基礎(chǔ)上，對巴山重樓70%乙醇提取物的正丁醇萃取部分進行了深入的研究，從中分離鑒定了10個甾體皂苷，除化合物1外，均首次從該種植物中分離得到，豐富了巴山重樓中甾體皂苷類成分的多樣性。本研究為該植物的應用開發(fā)提供了化學成分基礎(chǔ)，后續(xù)將開展該植物藥理活性方面的研究，為其資源的進一步開發(fā)提供充足的科學依據(jù)。