李啟東，趙金，孔娜，黃璐瑤，潘少斌*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 山東省高校中藥質(zhì)量控制與全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250355； 2. 山東藍(lán)城分析測(cè)試有限公司，山東 濟(jì)南250102)

展毛地椒Thymusquinquecostatusvar. przewalskii(Kom.) Ronn. 是百里香屬的重要植物之一,廣泛分布于山東境內(nèi)山地丘陵地區(qū)[1]。作為藥食兩用的天然植物，具有較高的開(kāi)發(fā)潛力與市場(chǎng)價(jià)值。展毛地椒(又名興凱百里香)或百里香ThymusmongolicusRonn.的干燥地上部分， 為中藥地椒[2-3],收載于1977年版《中國(guó)藥典》[4]和《中國(guó)植物志》[5]，在中醫(yī)古籍中常被作為主藥使用。中藥地椒別名地花椒、山椒、山胡椒，《本草綱目》即記載：“地椒出北地，即蔓椒之小者。貼地生葉，形小，味微辛”[6]，其性溫，有小毒，具有祛風(fēng)解表、行氣止痛、溫中健脾等功效，可用于治療胃痛、關(guān)節(jié)腫痛、腹痛、氣管炎、感冒、肌膚瘙癢等疾病[7]。此外，地椒作為歷史悠久的天然香料，還是日化用品和食用香精的重要原料[8]。1977年版《中國(guó)藥典》[4]中對(duì)地椒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅包括“來(lái)源、性狀、顯微鑒別、炮制、性味與歸經(jīng)、功能與主治、用法與用量、貯藏”項(xiàng)目，2020年常小強(qiáng)[6]參照2015年版《中國(guó)藥典》相關(guān)方法，制訂了地椒(興凱百里香)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。然而，目前針對(duì)地椒化學(xué)成分的研究仍相對(duì)較少。

百里香屬植物氣味芳香，現(xiàn)代研究表明，該屬含有揮發(fā)油、黃酮類、聯(lián)苯類、萜類甾體類、有機(jī)酸類等成分，揮發(fā)油是該屬中的重要成分之一，是發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。由于產(chǎn)地不同，其揮發(fā)性成分的含量和組成差異較大[9]。目前對(duì)地椒揮發(fā)油的研究主要采用水蒸氣蒸餾提取，再結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry , GC-MS)進(jìn)行分析[10]。但水蒸氣蒸餾法僅適用于難溶或不溶于水的成分提取，且存在提取率及提取純度較低等問(wèn)題。頂空固相微萃取技術(shù)(headspace-solid phase microextraction，HS-SPME)是一種新型的樣品預(yù)處理方法[11]，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，且萃取過(guò)程中無(wú)需加入有機(jī)溶劑，可更加準(zhǔn)確地分析待研究樣本中的揮發(fā)性成分[12]。本實(shí)驗(yàn)選用山東省臨沂市莒南縣所產(chǎn)展毛地椒，首次利用HS-SPME快速提取地椒地上部分揮發(fā)性成分，結(jié)合GC-MS分析，共鑒定出56種化學(xué)成分，為地椒藥材的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥材

地椒采自山東省臨沂市莒南縣，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為唇形科植物展毛地椒Thymusquinquecostatusvar. przewalskii (Kom.) Ronn.的地上全草，陰干后待用。

1.2 儀器與耗材

GC1310-TSQ8000 EVO氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；手動(dòng)固相微萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)，固相微萃取纖維萃取頭類型為：50/30 μm聚二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/ CAR/ PDMS)；20 mL具聚四氟乙烯膠墊瓶蓋頂空樣品瓶(美國(guó)Agilent公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市金壇友聯(lián)儀器研究所)；JY2002型電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；高純氦氣(純度≥99.999%，濟(jì)南堯天儀器有限公司)；NIST 2014數(shù)據(jù)庫(kù)(美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院)。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取

將固相微萃取的50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭置于氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的進(jìn)樣口中，于260 ℃下老化10 min。稱取3.0 g粉碎后的地椒樣品，置于20 mL頂空樣品瓶中，密封。于70 ℃恒溫水浴中頂空萃取60 min，隨后從樣品瓶中拔出萃取頭，拭去纖維萃取頭金屬保護(hù)套管上殘留水分，立即插入氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口，于260 ℃解吸3 min，進(jìn)樣分析。

1.3.2 儀器條件

1.3.2.1 氣相色譜條件

進(jìn)樣方式：手動(dòng)進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度260 ℃；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣；隔墊吹掃：5 mL/min；色譜柱：DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 升溫至90 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min 升溫至120 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至130 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 升溫至165 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升溫至200 ℃，以10 ℃/min 升溫至220 ℃，再以20 ℃/min 升溫至280 ℃，保持5 min，總運(yùn)行時(shí)間為57 min；載氣：高純氦氣(≥99.999%)，流速：1.0 mL/min。

1.3.2.2 質(zhì)譜分析條件

離子源類型：EI 源；電子能量：70 eV；接口溫度：280 ℃；離子源溫度：280 ℃；發(fā)射電流：50 μA；掃描方式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：29～400 aum；溶劑延遲：0 min。

2 結(jié)果

取地椒的地上部分經(jīng)HS-SPME提取后，進(jìn)行GC-MS分析，將所得質(zhì)譜圖與NIST 2014質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)，進(jìn)行定性分析，同時(shí)在完全相同的條件下，將正構(gòu)烷烴樣品進(jìn)行色譜分析，測(cè)定各正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，再根據(jù)公式(1)線性升溫保留指數(shù)計(jì)算公式算出各組分的Kovats保留指數(shù)。

RITP=100n+100[tR(x)-tR(n)]/[tR(n+1)-tR(n)]，

(1)

式中，RITP為Kovats保留指數(shù)；tR為被測(cè)組分的保留時(shí)間，下標(biāo)x為被測(cè)組分符號(hào)，下標(biāo)n和(n+1)為分別具有n和(n+1)個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴符號(hào)。

根據(jù)氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖(圖1)，圖中數(shù)值指RT(保留時(shí)間)，采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，測(cè)定其相對(duì)含量，共分離鑒定出56個(gè)化合物(見(jiàn)OSID)，主要結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 地椒地上部分頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the aerial part of Mongolian thyme herb obtained using HS-SPME-GC-MS

氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖顯示，經(jīng)過(guò)HS-SPME提取、GC-MS分析，所得成分主要以酚醇類、萜類、烯類、酯類、醛酮類為主，其中相對(duì)含量較多的是芳樟醇(27.8%)、龍腦(9.12%)、樟腦萜(8.12%)、檸檬烯(7.81%)、3-蒈烯(5.36%)。

峰號(hào)保留時(shí)間/min保留指數(shù)RI化合物名稱英文名稱分子式分子量面積歸一化含量/%18.099653-蒈烯3-careneC10H16136.235.3628.39979樟腦萜campheneC10H16136.238.1238.971005β-蒎烯β-pineneC10H16136.232.5449.261017左旋-β-蒎烯(1S)-(-)-β-PineneC10H16136.232.82710.221058檸檬烯cineneC10H16136.237.81810.631075羅勒烯ocimeneC10H16136.233.34910.91087γ-松油烯γ-terpineneC10H16136.231.691112.081134芳樟醇linaloolC10H18O154.2527.81514.011210龍腦borneolC10H18O154.259.121614.171215松油烯-4-醇terpinene-4-olC10H18O154.252.762516.041284乙酸芳樟酯linalyl acetateC12H20O2196.291.913220.431420β-波旁烯β-cyclobutaC15H24204.351.863421.621456β-石竹烯β-caryophylleneC15H24204.353.524123.61519大根香葉烯 Dgermacrene DC15H24204.353.354224.021533二環(huán)大根香葉烯dicyclic macrogeranieneC15H24204.351.564324.31543金合歡烯farneseneC15H24204.352.61

3 討論

常見(jiàn)的揮發(fā)油提取方法有水蒸餾法、溶劑提取法、吸收法、壓榨法，最常用的是水蒸氣蒸餾法。水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油成分效率低，且在高溫情況下有些揮發(fā)油會(huì)發(fā)生分解[13]。本實(shí)驗(yàn)首次將HS-SPME運(yùn)用到地椒揮發(fā)油成分的定性和定量分析中，HS-SPME具有采樣、萃取、富集、脫附、進(jìn)樣的功能，裝置操作簡(jiǎn)單且可精確分析地椒中的揮發(fā)性成分[14]，節(jié)約時(shí)間、準(zhǔn)確性高、安全性強(qiáng)[15]，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生化等領(lǐng)域[16-17]。

地椒中含有多種不同的化學(xué)成分，如揮發(fā)油、黃酮類、甾體類、有機(jī)酸類和萜類等[7,18]，但目前研究最為廣泛的為地椒揮發(fā)油。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)GC-MS結(jié)合保留指數(shù)方法，鑒定出地椒揮發(fā)油中56種揮發(fā)性成分。所得成分主要以酚醇類、萜類、烯類、酯類、醛酮類為主，其中相對(duì)含量較多的分別是芳樟醇(27.8%)、龍腦(9.12%)、樟腦萜(8.12%)、檸檬烯(7.81%)和3-蒈烯(5.36%)等。現(xiàn)代藥理研究表明，地椒揮發(fā)油具有抗菌、抗腫瘤、抗血栓、抗氧化等活性[19]。

芳樟醇目前除廣泛應(yīng)用于洗化用品、食用香精外，還具有明顯的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗焦慮、催眠、抗菌消炎、抗腫瘤的藥理活性。Huo等[20]研究發(fā)現(xiàn)，芳樟醇無(wú)論在體內(nèi)外，均能有效抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的促炎癥因子TNF-α和白介素-6(IL-6)的表達(dá)，起到抗炎作用，并發(fā)現(xiàn)阻斷核因子 NFκB 和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路可能是其發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制。此外，張婷等[21]研究發(fā)現(xiàn)芳樟醇通過(guò)上調(diào) p53、p21、p27、p57 等DNA 損傷相關(guān)基因的表達(dá)，能明顯抑制多種人淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖，而對(duì)正常骨髓造血細(xì)胞及外周血細(xì)胞的增殖沒(méi)有顯著影響，因此推斷其具有一定的抗腫瘤作用。桉樹(shù)腦類成分作為單萜類化合物，是植物精油的重要組成部分。現(xiàn)代研究表明，單萜類化合物特別是1,8-桉樹(shù)腦及其衍生物具有抑菌活性和殺菌能力。通過(guò)對(duì)1,8-桉樹(shù)腦合成衍生物進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)白色念珠菌和金黃葡萄球菌具有明顯的抑制效果[22-23]。而單萜類和倍半萜類例如桉樹(shù)腦和莰酮等對(duì)家蠅和蟑螂具有強(qiáng)的驅(qū)避活性，這與民間用藥經(jīng)驗(yàn)基本相符[24]。

地椒作為多種復(fù)方藥物制劑的重要組成部分，具有較好的市場(chǎng)前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值。地椒揮發(fā)油具有含量高、品質(zhì)優(yōu)、無(wú)殘留、耐抗藥性等特點(diǎn)，而且在醫(yī)藥、精細(xì)化工及日常生活中應(yīng)用廣泛，長(zhǎng)久以來(lái)被視為天然植物精油中的極品[25]。隨著人們對(duì)天然香料需求量的增加，地椒常用作肉類除膻劑，廣泛用于食品生產(chǎn)，其含有的鄰傘花烴、香荊芥酚及石竹烯等均可用于調(diào)配香料香精，具有廣闊的使用前景[26]。本實(shí)驗(yàn)為地椒揮發(fā)油的提取提供了新的思路，也為地椒的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。