楊 瑤，斯能武，嚴鈺澳，覃 瑞，吳智華，張 麗

（中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，湖北武漢 430074）

近年來，肉制品摻假事件的相關(guān)報道頻頻出現(xiàn)，例如2013年歐洲的“馬肉風(fēng)波”[1]、國內(nèi)市場的“老鼠肉、狐貍?cè)夂退跞饷俺渑Ｑ蛉狻?、“鴨肉制牛羊肉卷”等事件[2]。雖然國內(nèi)外政府部門都明文規(guī)定食品制造商應(yīng)當在食品包裝上標注配料種類及含量[3]，但仍有許多不法商販為了賺取高額利潤，以價格低廉的鴨肉、雞肉、豬肉、水貂肉及其他動物肉冒充價格較高的羊肉、牛肉[4]。特別是在牛、羊肉中摻入豬肉，既損害了消費者的利益，影響了肉制品貿(mào)易的公平性，還觸犯了宗教中的飲食禁忌[5]。

近幾十年來，以核酸為標志物的肉制品鑒別檢測方法飛速進步，并獲得了廣泛應(yīng)用[5-7]。在GB/T 35917-2018常見動物源性成分快速測定中，利用線粒體ATPase6,cox1,cytb,D-loop等基因序列對肉制品及飼料中豬、黃牛、羊、雞、兔、驢、貂、狐、鼠、牦牛、鴨，共11種常見動物源性成分進行快速檢測[8]。CAMMA等[9]利用cytb和16SrRNA對火雞、雞、牛、豬、羊進行鑒別。SAFDAR等[10]建立了基于cytb和12S rRNA基因的SYBRGreen二重?zé)晒舛縋CR方法，可同時檢測肉制品中牛源性和雞源性成分。KIM等[11]建立了基于D-loop基因的Taq-man熒光定量PCR方法對豬源性成分進行檢測。HAIDER等[12]建立了基于COI基因的PCR-RFLP檢測方法。線粒體DNA在細胞內(nèi)有較多的拷貝數(shù)，cyt-b、12SrRNA、16SrRNA、D-loop、COI等基因均位于線粒體基因組上，以線粒體基因為檢測靶標有助于提高檢測的靈敏度[13]。但是由于線粒體DNA拷貝數(shù)在相同組織的不同時期，以及不同組織如肌肉、內(nèi)臟中差異顯著[14]，基于線粒體DNA的檢測方法僅適用于定性分析[15-16]。

細胞核單拷貝基因在動物不同時期、組織中都具有較為穩(wěn)定的拷貝數(shù)，近年來物種特異的單拷貝靶序列成為動物源成分定量檢測的熱點[17-18]。基于細胞核單拷貝基因的實時熒光定量檢測方法具有特異性強、靈敏度高、結(jié)果較為準確等優(yōu)點，亟需針對各種動物篩選具有物種特異性的細胞核單拷貝基因[19-20]。本研究通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)手段篩選和分離豬（Susscrofa）細胞核基因組中特異性的單拷貝基因，設(shè)計豬特異性擴增引物與探針，建立Taq-man實時熒光定量PCR方法，考察其在不同物種間的特異性、在豬不同品種間的穩(wěn)定性，以及檢測的靈敏度。并對已知豬DNA含量的混合DNA樣品和已知豬肉含量的混合肉樣進行定量檢測，考察檢測方法的適用性。為肉制品中豬源性成分的定性檢測和定量分析提供方法參考，為肉制品貿(mào)易的監(jiān)督和管理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6個不同品種豬肉（恩施黑豬、恩施土豬、黃陂土豬、雙匯豬肉、中糧豬肉、野豬）、13種動物（雞、鴨、鵝、牛、驢、羊、狗、魚、魷魚、蝦、扇貝、駱駝、小鼠）、5種植物（大豆、小麥、玉米、擬南芥、煙草）為本實驗室收集并保存，材料詳細信息如表1所示；菜場牛肉丸、魚丸、超市品牌牛肉丸、品牌羊肉卷、品牌肥羊卷、品牌肥牛卷、品牌牛排等肉制品 市售；Hieff PCR Master mix（貨號10102ES03）、HieffTMqPCR SYBR Green Master Mix（貨號11201ES08）、HieffTMqPCR TaqMan Probe Master Mix（貨 號11205ES08） 上海翊圣生物技術(shù)有限公司；DNA小量提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit（貨號69104）

表1 特異性驗證實驗中所用到的材料的詳細信息Table 1 Detailed information about the materials used in species specificity analysis

Qiagen公司；PCR引物 上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

NanoPhotometer NP80超微量紫外分光光度計Implen公司；C1000 Touch Thermal Cycler定性PCR儀、CFX96定量PCR儀 Bio-Rad公司；UVCI-1100凝膠成像系統(tǒng) Major science公司；5424小型離心機 Eppendorf公司；ME303分析天平 梅特勒-托利多公司；DHG-9240A鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；JYL-G12絞肉機 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 采集不同動物的新鮮肌肉組織，家禽采集胸部肌肉，家畜、小鼠、駱駝、草魚采集脊柱背側(cè)肌肉，魷魚采集外套膜肌肉、蝦采集腹部肌肉，扇貝采集閉殼肌，剔除樣品中的肌腱和脂肪，用組織絞肉機絞碎后，置于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘約72 h。烘干的樣品粉末放入滅菌潔凈的研缽中，加入液氮迅速研磨成細小的粉末備用。處理過程中不同肉類要分開，以防止不同來源的動物組織交叉污染。

1.2.2 基因組DNA的提取與檢測 稱取12 mg液氮研磨后的鮮肉粉末置于2.0 mL滅菌離心管中，按照汪永慶等[21]的方法提取動物基因組DNA。按照植物DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit的說明書提取植物葉片基因組DNA。使用超微量紫外分光光度計測定提取后的基因組DNA濃度與純度，用于實驗的基因組DNA樣品OD260/280值應(yīng)在1.80左右。使用真核生物18S rDNA基因引物[22]（表2）對提取的基因組DNA進行SYBR Green I實時熒光定量PCR擴增（反應(yīng)程序與體系見1.2.5），判斷基因組DNA的可擴增性。

表2 引物和探針的序列Table 2 Primer and probe sequences

1.2.3 豬特異性基因的獲取 根據(jù)GenBank中豬（Susscrofa）全基因組序列信息（ID: 84），利用生物信息學(xué)方法進行全基因組自我比對，只能對本序列匹配的基因，可判定為單拷貝基因。然后將候選的單拷貝基因在NCBI中進行Blastn分析，篩選出特異強、同源序列少的基因序列。以這些基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計PCR引物，并對PCR擴增片段進行再次Blastn分析，以保證擴增片段的特異性。

1.2.4 定性PCR擴增和檢測 定性PCR反應(yīng)體系為：20 ng/μL的DNA 模板2 μL，Hieff PCR Master mix 25 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.8 μL，ddH2O補足至50 μL。定性PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)進行檢測。PCR產(chǎn)物送至武漢擎科生物科技有限公司進行測序。

1.2.5 熒光定量PCR反應(yīng)體系與程序 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.4 μL，ddH2O補足至20 μL。SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，40個循環(huán)；熔點曲線：65～95 ℃每隔0.5 ℃讀板一次，16 ℃保溫。

實時熒光定量PCR（TaqMan）反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，Hieff qPCR TaqMan Probe Master Mix 10 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.4 μL，10 μmol/L探針0.2 μL，ddH2O補足至20 μL。TaqMan實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸1 min，40個循環(huán)。所有PCR反應(yīng)設(shè)置3個平行。

1.2.6 檢測方法的特異性、靈敏度和可靠性 以1.2.2中提取的6種豬（恩施黑豬、恩施土豬、黃陂土豬、雙匯豬肉、中糧豬肉、野豬）、13種其他動物（雞、鴨、鵝、牛、驢、羊、狗、魚、魷魚、蝦、扇貝、駱駝、小鼠）和5種植物（大豆、小麥、玉米在食品添加劑中常見，擬南芥和煙草為模式植物）的基因組DNA為模板，按照1.2.5中反應(yīng)程序與體系進行實時熒光PCR擴增，驗證檢測方法對豬擴增的穩(wěn)定性，以及對其他動物和植物的特異性。將豬基因組DNA梯度稀釋至20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064 ng/μL，以其作為模板進行TaqMan實時熒光定量PCR擴增，考察檢測方法的靈敏度和可靠性。

1.2.7 樣品檢測 將20 ng/μL的豬DNA與20 ng/μL的羊DNA混合，制成豬DNA含量分別50%、20%、10%、1%、0.1%、0%的DNA混合樣品，以之為模板進行熒光定量PCR檢測。將豬肉粉末與羊肉粉末混合，豬肉粉末含量分別為50%、20%、10%、5%、1%、0%，將混合的肉樣品提取基因組DNA后，進行熒光定量PCR檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗設(shè)置3個平行，每組實驗重復(fù)3次，結(jié)果以3次重復(fù)的平均值±標準偏差（SD）表示。利用CFX96定量PCR儀自帶的軟件Bio-Rad CFX Maestro 1.0分析熒光定量PCR擴增曲線和Ct值。利用Microsoft Excel 2016對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選DNA序列的篩選

通過對豬的全基因組序列的自我比對以及Blastn分析，篩選到豬細胞核基因組中的單拷貝基因（XM021097549，carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule2-like，CACA）。以之為模板設(shè)計多對引物序列，利用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR對不同引物對進行比較，選取擴增曲線穩(wěn)定、熔解峰清晰單一的引物對，并設(shè)計Taq-man探針。最終選取的引物探針序列如表2所示，該序列的Blastn分析結(jié)果如圖1所示，比對結(jié)果表明該序列在其他生物中均無相似性高的序列。

圖1 CACA基因擴增序列的Blastn分析Fig.1 Blastn analysis of the amplified sequence of CACA gene

2.2 物種特異性鑒定

以13種其他動物（雞、鴨、鵝、牛、驢、羊、狗、魚、魷魚、蝦、扇貝、駱駝、小鼠）和5種植物（大豆、小麥、玉米在食品添加劑中常見，擬南芥和煙草為模式植物）的基因組DNA為模板，進行種外擴增特異性實驗。首先利用18S rDNA基因引物對上述18份基因組DNA進行SYBR Green I實時熒光定量PCR擴增，結(jié)果均有典型的擴增曲線，空白對照無擴增，表明DNA具有良好的可擴增性（圖2A）。以引物探針組合CACAF21/R162/P69對上述18份基因組DNA進行種外擴增特異性實驗。結(jié)果顯示該引物探針組合對13種其他動物以及5種植物的基因組DNA均無擴增（圖2B），表明引物探針組合CACAF21/R162/P69對其他動物和植物具有良好的特異性。

圖2 檢測方法種外特異性分析Fig.2 Inter-species specificity analysis of detection method

以6種豬（恩施黑豬、恩施土豬、黃陂土豬、雙匯豬肉、中糧豬肉、野豬）的基因組DNA為模板，以引物組合CACAF21/R162進行定性PCR擴增，結(jié)果均有142 bp擴增條帶（圖3A）。對6個擴增條帶進行序列測定，DNA序列與理論上一致。以引物探針組合CACAF21/R162/P69進行TaqMan實時熒光定量PCR，均有典型的擴增曲線（圖3B）。表明引物探針組合CACAF21/R162/P69在不同品種豬中一致性、穩(wěn)定性好，且對其他動物和植物具有良好的特異性，可作為豬特異性的細胞核單拷貝基因用于豬源性成分的檢測。

圖3 檢測方法種內(nèi)穩(wěn)定性分析Fig.3 Intra-species stability analysis of detection method

2.3 檢測方法的靈敏度和可靠性

以梯度稀釋的豬DNA為模板，利用CACAF21/R162/P69引物探針組合進行TaqMan實時熒光定量PCR擴增，擴增Ct值如表3所示。可檢測到的模板DNA濃度低至0.032 ng/μL，表明該方法靈敏度良好。獲得的擴增曲線如圖4A所示，根據(jù)梯度稀釋的擴增曲線可繪制標準曲線（圖4B）。在20～0.032 ng/μL的DNA濃度范圍內(nèi)，模板DNA和擴增Ct值之間存在良好的線性關(guān)系，標準曲線為y=-3.508x+28.636，線性決定系數(shù)R2為0.997，擴增效率為92.8%，表明該方法可以用于定量檢測中[23]。

圖4 實時熒光定量PCR方法的標準曲線Fig.4 Standard curves for the real-time PCR systems

表3 豬實時熒光定量PCR方法的靈敏度和可靠性Table 3 Sensitivity and reliability of real-time quantitative PCR for detection of pig DNA

2.4 模擬樣品的定量檢測

利用CACAF21/R162/P69引物探針組合對豬DNA含量分別50%、20%、10%、1%、0.1%、0%的DNA混合樣品進行熒光定量PCR檢測，模板DNA濃度為20 ng/μL，將獲得的Ct值代入標準曲線，計算豬DNA的百分含量（表4）。實驗結(jié)果表明，當豬DNA含量低至0.1%時，相對標準偏差為22.28%，相對誤差為11.37%。

對豬肉粉末含量分別為50%、20%、10%、5%、1%、0%的肉樣品提取基因組DNA后，進行熒光定量PCR檢測，將獲得的Ct值代入標準曲線，計算豬DNA的百分含量（表4）。實驗結(jié)果表明，當肉粉中豬肉含量為5%時，相對標準偏差為15.61%，相對誤差為11.92%，當肉粉中豬肉含量為1%時，相對標準偏差為25.25%，相對誤差為14.16%。根據(jù)CAC/GL 74-2010對基于DNA的定量檢測方法的要求，RSD值應(yīng)不超過25%。因此該方法可以檢測DNA含量低至0.1%的混合DNA樣品，以及肉含量低至5%的混合肉制品。

表4 已知摻假比例的模擬混合樣品的實時熒光定量PCR檢測Table 4 Real-time PCR quantitative analysis of simulated samples with known adulteration ratio

2.5 市售肉制品的檢測

將所建立的實時熒光定量檢測方法對菜場牛肉丸、魚丸、超市品牌牛肉丸、品牌羊肉卷、品牌肥羊卷、品牌肥牛卷、品牌牛排等7種市售肉制品進行檢測，同時以18SrDNA的擴增證明DNA的可擴增性。檢測結(jié)果如圖5和表5所示。菜場的牛肉丸、魚丸、超市品牌牛肉丸、品牌羊肉卷基因組DNA均對CACAF21/R162/P69引物探針組合有典型的擴增，證明其中含有豬肉成分。將獲得的Ct值代入標準曲線，按20 ng/μL的總DNA計算，其中豬肉DNA含量分別為41.83%、8.03%、13.32%、49.39%，表明在菜場牛肉和超市品牌羊肉卷中含有較多的豬肉成分。菜場的牛肉丸、魚丸標簽上均未標識含有豬肉成分，因此在市場上確實存在欺瞞消費者的情況。超市品牌牛肉丸和品牌羊肉卷在其配料表中注明含有豬肉成分，但是并未標識出含量，通過檢測發(fā)現(xiàn)品牌羊肉卷中含有大量的豬肉。通過市售肉制品的檢測，表明本研究建立的方法可以準確可靠地判定肉制品中是否含有豬肉成分，并可用于豬肉成分的定量檢測。

表5 市售肉制品的實時熒光定量PCR檢測Table 5 Real-time PCR quantitative analysis of commercial available meat products

圖5 市售肉制品的實時熒光定量PCR擴增曲線Fig.5 Detection results of commercial available meat products

3 結(jié)論與討論

肉制品摻假事件屢屢發(fā)生，建立有效的檢測方法對維護消費者權(quán)益，保障肉制品貿(mào)易公平性具有重要意義[24]。細胞核基因較線粒體基因具有更強的定量準確性[25-26]，近年來越來越多的研究利用細胞核單拷貝基因?qū)游镌次锓N成分進行定量檢測。WU等[27]建立了基于細胞核單拷貝基因的實時熒光定量PCR方法，對狐貍、貂、狗、兔進行特異性檢測，可對摻雜含量低至5%的DNA樣品準確檢測。唐廷廷[28]以山羊CAST基因、雞CAPN2基因為靶標，建立了能實現(xiàn)定量檢測羊肉中雞肉質(zhì)量百分比的方法，最低檢測極限可達5%（w/w）。CAI等[29]以雞TGFB3基因、豬β-actin基因為靶標，建立數(shù)字PCR方法對肉制品中雞肉和豬肉含量進行定量檢測，可準確檢測含量低至10%（w/w）的雞肉和豬肉成分。值得注意的是，由于不同動物、不同組織、同一動物不同組織單位重量樣品的DNA含量不同，DNA提取效率也不盡相同，動物DNA拷貝數(shù)與組織重量間沒有明確的換算關(guān)系，因此，在檢測加工肉制品時，難以通過DNA拷貝數(shù)百分比來直接計算樣品中某一種肉組分的含量[30]。

本研究以豬特異的細胞核單拷貝基因為研究對象，通過生物信息學(xué)方法篩選到豬細胞核單拷貝基因CACA，并建立了基于豬CACA基因的Taq-man實時熒光定量PCR檢測方法。研究結(jié)果表明，該方法特異性強、靈敏度高，在20～0.032 ng/μL的DNA濃度范圍內(nèi)，模板DNA和擴增Ct值之間存在良好的線性關(guān)系。在相對標準偏差≤25%的條件下，可準確檢測豬DNA含量低至0.1%的DNA樣品，豬肉含量低至5.0%（w/w）的肉制品。該方法的靈敏度和準確性與其他基于細胞核基因的檢測方法相當[26-31]。對市售的肉制品檢測結(jié)果表明，目前市場上存在含有豬肉成分卻未標識，以及標識有豬肉成分但含量無法得知的情況。本研究建立的方法可準確識別出肉制品中是否含有豬肉成分，并可用于豬肉含量的定量檢測，可為肉制品日常檢測及是否摻假提供有力的科學(xué)依據(jù)。